基于“活性成分-靶点-通路”网络药理学，探讨蒙药四味石榴散治疗高脂血症的作用机制＊

葛莎莎，李建良，蔡淑珍，图 雅

（1. 中国中医科学院医学实验中心 北京 100700；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700；3. 内蒙古民族大学蒙医药学院 通辽 028000；4. 中国中医科学院中医药研究发展中心 北京 100700）

蒙药四味石榴散（阿那日-4 味散）源于《观者之喜》，由石榴（Punica granarum L.）、肉桂（Cinnamomum cassia Presl）、白 豆 蔻（Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.）、荜茇（Piper longum Linn.）等四味药组成；具有补充胃火，开胃，助消化，除巴达干赫依，揭除隐热之掩蔽功能[1]。临床用于不消化病、灰白巴达干、胃呆、胃火衰败等症。方中石榴乃是祛寒药物之首，为主药；肉桂味辛性热、腻、锐、滑，具抑制巴达干赫依，祛除巴达干寒邪的作用，为辅药；荜茇性热以调理体素，补充胃火，除巴达干赫依，为佐药；豆蔻止吐，开胃，消食，补充胃火，为使药。

高脂血症（Hyperlipidemia）亦称为高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia），属于代谢综合症之一[2]，临床中血清总胆固醇（total cholesterol，TC）＞6.22 mmol/L或（和）甘油三酯（triglyceride，TG）＞2.26 mmol/L 即被判定为血脂异常升高[3]；我国成人血脂调查显示血脂异常发病率为34.0%，男性发病率41.9%高于女性发病率32.5%[4]，且逐年增加；易引发动脉粥样硬化，冠心病，脑卒中等高死亡率疾病，危害大。其发病多与饮食方式、肥胖、年龄、及家族遗传等因素相关[5-6]。发病机制与载脂蛋白（Apo）基因突变，低密度脂蛋白受体（LDLR）异常，脂肪代谢酶活性降低等相关[7]。

蒙药四味石榴散是经典蒙药复方，是蒙医治疗消化不良、巴达干赫依等病的基础方剂，比如在阿那日-4 汤复方的基础上加红花制成通拉嘎-5，主要用于消化不良、巴达干赫依等病。临床研究[8-9]表明五味清浊散能够明显降低高脂血症患者血清的TC、TG、LDL-C水平。方中石榴[10]、荜茇[11]、肉桂[12]等单药均有降血脂功效报道，但该类复方的降血脂现代研究报道较少见。网络药理学具有系统生物学、计算生物学、整合药理学等多学科配合的优势[13]，适合分析中药及民族药多成分多靶点多通路、整体性特点[14]，能很好提供方剂多靶点交互信息网，方便富集方剂药理通路及阐释作用机制[15]。因此，本研究尝试用网络药理学技术将四味石榴散作用靶点与降高血脂靶点进行对接，旨在利用网络药理学技术探索四味石榴散降高血脂作用机制，为开发四味石榴散临床新应用及现代医学的基础研究提供思路。

1 材料与方法

表1 四味石榴散活性化合物

1.1 药物活性化合物获取及筛选

通过TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[16]、化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）对四味石榴散中四味药所含全部化合物进行搜集。根据口服利用度（OB）＞0.30 与类药性（DL）＞0.10 制定筛选标准，将1.1 所搜集的化合物根据此标准进行筛选，以四味药中具有药理活性报道的化合物为优先筛选；将其输入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查询并转化为标准的Canonical SMILES格式。

1.2 活性化合物靶点预测

将1.1 活性成分的SMILES 格式文件导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平台[17]，物种属性为“Homo sapiens”，收集预测到的所有靶点，并除重。

1.3 高脂血症疾病潜在靶点的搜集

采用Pubmed 中疾病分类中高脂血症相关的“hyperlipidmedia”“dyslipidemia”为关键词，通过OMIM（http://www.omim.org/），DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home） ， DiGSeE （http://210.107.182.61/geneSearch/）以及GeneCard（http://www.genecards.org/）四个疾病靶点网站搜集高脂血症的潜在靶点，并除重，与1.3 获得的成分靶点相匹配，相一致者为四味石榴散治疗高脂血症的潜在靶点。

1.4 生物过程与通路的富集分析

将靶点导入至string（https://string-db.org/）[18]分析网站，进行靶点蛋白交互作用分析；将潜在靶点导入至Metascape[19]平台，对四味石榴散进行GO 和KEGG通路分析，分析其结果，并采用Cytoscape3.5.1[20]和GraphPad Prism 7.0软件对结果可视化。

2 结果

2.1 四味石榴散活性化合物

四味石榴散中石榴主要含有鞣质、生物碱、黄酮类等成分，荜茇主要含有生物碱、萜类、挥发油等成分；肉桂、白豆蔻主要以挥发油成分为主。利用TCMSP 数据库和化学专业数据库，通过口服生物利用度和类药性制定标准筛选，最终获得16个具有较高活性的化合物（见表1）。

2.2 靶点预测及筛选

基于Swiss Target Prediction 平台来预测活性化合物的潜在靶点，筛选probability ＞0并除重，共获得391个靶点。通过与DisGeNET、GeneCard、OMIM、DiGSeE疾病数据库中高脂血症的相关靶点进行比对，最终筛选出35 个可能与四味石榴散治疗高脂血症相关的靶点（表2）。

2.3 基因功能和通路富集分析

2.3.1 靶点互相作用分析

利用String 分析得出12 个聚类结果，最高enrichment score 为3.06，包 含 脂 质 代 谢（lipid metabolism）、类固醇代谢（steroid metabolism）、胆固醇代 谢（cholesterol metabolism）、固 醇 代 谢（sterol metabolism）四个条目（见图1）。聚类结果显示，HMGCR、PPARA、PPARG、HIFA1、IL-6 等靶点与其他靶点蛋白连接较多。

表2 35个可能与四味石榴散治疗高脂血症相关的靶点

图1 靶点相互作用结果图

2.3.2 GO通路分析

将四味石榴散治疗高脂血症的35 靶点上传到Metascape 平台，经GO 注释分析分子功能(Molecular Function，MF）和生物过程(biological process，BP），设置阈值P＜0.01，minimum count 3、enrichment factor ＞1.5，共收集到374 条MF 条目，360 条BP 条。通过Kappa scores 作为相似性参数，将相似性＞0.3 的条目进行分层聚类分析并通过Cytoscape3.5.1 软件绘制富集分析聚类网络图（图1A、图1B），每个条目由节点表示，圆形大小与输入基因的数量成正比，而相同颜色的节点属于同一簇，每一簇当中选择P 值作为代表展示在右下角。具有相似性得分＞0.3 的条目由边连接，边的粗细表示相似性得分的高低。

图2 GO注释分析图

图3 KEGG富集分析热图

四味石榴散35个预测靶点的BP 富集结果显示大部分与脂质定位，合成，转运（lipid localization, lipid biosynthetic process，lipid transport）、胆 固 醇 代 谢（steroid metabolic process）、羧酸代谢（monocarboxylic acid metabolic process）等生物过程相关，另与激素水平的调节（regulation of hormone levels,hormone metabolic process）联系密切；MF 富集结果显示与多肽反应（response to peptide），脂质储存功能（lipid storage），受体合成（receptor biosynthetic process）等分子功能有关。

2.3.2 KEGG通路富集分析

基于Metascape 网站的KEGG 富集分析平台，将35个活性靶点导入，富集分析共获得31条KEGG 信号通路，通过聚类分析，选择有代表性的条目采用GraphPad Prism 7.0 对其结果进行热图可视化（图3）。有脂肪消化与吸收（Fat digestion and absorption）、Thelper type 17 （Th17） 细 胞 分 化（Th17 cell differentiation），花生四烯酸代谢（Arachidonic acid metabolism），PPAR 通路（PPAR signaling pathway），胆汁分泌（Bile secretion），血管平滑肌收缩（Vascular smooth muscle contraction），腺苷单磷酸信号通路（cAMP signaling pathway），神经活动受体-配体相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）。

2.3.3 四味石榴散治疗高脂血症“活性成分-靶点-通路”

将上述所得到的的化合物、作用靶点和富集的GO 与KEGG 通路信息导入Cytoscape 软件中构建“活性成分-靶点-通路”网络。在输出的网络（图4）中，以不同颜色的节点表示化合物、靶点以及作用通路，其中：黄色菱形节点代表全石榴活性成分，红色六边形节点代表作用靶点，浅蓝色长方形代表作用通路。若某一靶点为活性化合物的潜在靶点，则以边相连，若某一蛋白对某条通路具有调节作用，也通过边连接。从图中可以看出四味石榴散具有多种活性成分，每种成分对应多个作用靶点及通路，体现出“一对多”和“多对一”药理作用关系。

3 讨论

图4 四味石榴散化合物-靶点-通路网络图

蒙医理论认为，高脂血症是由于饮食不节，过食甘凉、油腻食物，引起体内消化巴达干增盛，三根紊乱，胃火衰败，继而肝脏的色变希拉无法“分清泌浊”导致血中精华不消，糟粕粘液增多引发高脂血症[21]。现代医学认为，高脂血症属于代谢不良疾病，甘油三酯和胆固醇产生过多或代谢减慢导致血浆中LDL 升高[3]，甚至堆积在血管壁引发心血管疾病[22]；蒙医常选用以调理胃火，祛巴达干寒，消食，开胃的石榴为主药的复方制剂，譬如四味石榴散、五味清浊散（四味石榴散加红花）等。为发掘复方蒙药降高血脂的研发开辟新途径，在防治高血脂症领域里增添蒙医药的新内容，本研究利用网络药理学技术探索了四味石榴散主要活性成分，对接了与高血脂相关的靶点及作用通路，阐述了蒙医治疗高脂血症的物质基础及与现代医学的联系。

String 靶点蛋白相互作用网络图显示HMGCR 与其他靶点联系密切，HMGCR 为胆固醇合成过程的限速酶，提示蒙药四味石榴散可能是通过下调HMGCR活性，限制胆固醇合成，下调LDL 降低高血脂。GO 富集分析结果显示集中在脂肪酸的合成、转运和代谢，以及胰岛素和激素水平调节有关，说明四味石榴散通过多靶点起效，从糖脂代谢到激素调节都有参与降脂的生物过程；KEGG 富集分析显示主要参与通路有脂肪酸代谢通路，PPAR 信号通路，文献报道PPAR 可调控肝脏内的脂肪酸氧化代谢，降低甘油三酯，维持脂质稳态[23]，提示四味石榴散作用靶器官可能为肝脏，通过提高肝内脂肪酸的氧化分解降低LDL的生成。

成分-靶点-通路网络充分展示了四味石榴散多成分、多靶点、多通路治疗高脂血症的作用特点。方剂中含有的槲皮素可降低血清和肝组织TC，TG 含量，激活PPARγ/LXRα通路[24]提高清道夫受体表达从而降低胆固醇蓄积[25]；鞣花酸具有抑制内源性TC、TG 合成，升高HDL-C，促进胆固醇逆转运，改善脂质在体内的沉积，具有抗氧化保护肝细胞功能[26]；胡椒碱及其衍生物可调节脂代谢紊乱[27]，能有效降低高血脂地鼠血清TC、TG 水平[28]；荜茇宁可上调高血脂地鼠LDLR 数量，降低ApoB数量，增加LDL代谢来降低血脂水平[29]。蒙药四味石榴散方剂中的槲皮素，鞣花酸，胡椒碱，荜茇宁预测出靶点较多，富集的通路LogP 值高，提示在方剂中这些化合物活性高，起主要降血脂作用，与文献报道相一致。另免疫系统在本研究结果中表现突出，参与血脂调节密切，花生四烯酸途径说明机体高血脂状态容易引发炎症；Th17 细胞为CD4+T 细胞分化亚型之一，与调节性T 细胞（Treg）为一对平衡，文献报道高脂血症会使肝T 细胞向Th17 分化，Treg 细胞功能降低，机体处于免疫亢进状态，易引发由高血脂转变的动脉粥样硬化等心血管疾病[30-31]，因此Th17 细胞分化通路参与提示适应性免疫在高脂血症发病中发挥重要作用。

生物信息学的快速发展使得小分子化合物库得以全面建立，目前，已构建出TCMSP 等多种适合研究筛选中医药活性小分子的化合物库，结合分子对接技术可展现出中药药效的物质基础，初步阐明既包括中医药多靶点多通路整体论治的特色，也具有现代化医药精准医疗的理念；符合中医药现代化和推广国际的方针；同时，民族医药也紧随其后，本研究中的蒙药四味石榴散在临床应用已久，主要机理为“分清泌浊”，但具体作用机制尚未明确，通过对蒙药四味石榴散进行网络药理学研究发现，其可通过cAMP 信号通路、PPAR 信号通路、PI3K-AKT 信号通路等起到调节血脂，降胆固醇作用，为临床应用提供了理论基础。目前，基于计算机模拟的网络药理学具有一定局限性，算法的匹配程度直接影响对接结果，其准确度还需实验验证，但仍不失为一种有力手段。

综上所述，蒙药四味石榴散可通过干预与脂肪酸代谢、激素调节、免疫稳态等相关通路，起到祛巴达干赫依的作用来治疗高脂血症，为进一步临床应用和基础研究提供了思路。