参附益心方对缺氧条件下大鼠原代心肌细胞线粒体DNA相关基因表达的影响＊

马 腾，李 彬，王新陆，谢世阳，高 原，朱明军，王永霞

（1. 河南中医药大学 郑州 450000；2. 河南中医药大学第一附属医院 郑州 450000）

心力衰竭（简称“心衰”）是各种临床心脏疾病发展到晚期阶段的一种表现，其发生、发展过程复杂，死亡率居高不下[1]。心衰时，心肌细胞处于能量代谢失衡状态，可导致心肌收缩功能不全和心室重构的进展。线粒体是能量代谢的枢纽，是细胞中的“发电站”，也是脂肪、糖和氨基酸氧化和释放能量的最后场所。而线粒体DNA(mtDNA)的表达，是电子传递链、氧化磷酸化和ATP 合成的重要组成部分，对心肌细胞能量代谢具有重要意义。

参附益心方源自于河南中医药大学，是孙建芝教授治疗慢性心衰的临床经验方，具有益气、温阳、活血、利水等功效。当下认为，中医中的“气”与现代医学的“能量”、“ATP”具有相同的物质基础[4]，从气血理论方面可对参附益心方改善心衰患者心功能、改善预后进行阐述。前期临床研究发现参附益心方能改善心衰患者症状、心功能、提高生活质量及改善预后[5]。另外，本课题组经过前期相关基础研究[6-9]，发现参附益心方可能通过调控相关miRNA、信号通路发挥改善心肌细胞能量代谢的作用，从而发挥改善心功能、抗心衰、延缓或逆转心肌重构的作用。本试验在缺氧诱导的原代心肌细胞损伤模型中，通过观察参附益心方对缺氧诱导的心肌细胞ATP 和LDH 含量，ND-1、ND-2、COX、tfam基因的表达，进一步验证参附益心方对心肌细胞线粒体DNA基因表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级1-3 d 新生SD 乳大鼠，购自河南省实验动物中心，雌雄不限，生产许可证号：SCXK（豫）2015-0005。

1.2 仪器设备

TDL-50B 型低速台式大容量离心机（北京医用离心机厂）；MK3型酶标仪（德国Thermo Scientific 公司）；JA203 型电子分析天平（上海海康电子仪器厂）；IKAV-MAG HST 型磁力搅拌器（中国苏州艾卡公司）；BCM-1000A型生物超净工作台（江苏苏净集团安泰公司）；DMI 3006倒置荧光显微镜(德国莱卡公司)；CK 40倒置显微镜（奥林巴斯公司，日本）；Rco-3000tvbb 二氧化碳培养箱（Revco，美国）；Inucyte zom 长时间细胞动态成像分析系统（Sensi技术有限公司）；ABI 7300型荧光定量PCR仪（美国AB公司）。

1.3 实验试剂

Dulbecco's Modified EagleMedium（DMEM）培养基（Solarbio公司）；0.08%心肌细胞消化液（Trypsin 0.16 g；NaCl 1.6 g；NaHCO30.070 6 g）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司）；磷酸盐平衡液PBS（NaCl 8.00 g；KCl 0.20 g；Na2HPO41.56 g；KH2PO40.24 g；ddH2O 1 000 mL）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；葡萄糖0.198 2 g；KCl 0.059 6 g；HEPES 0.4 g；ddH2O 200 mL）；YOYO-1染料（美国Invitrogen公司）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美国西格玛公司）；溴脱氧尿核苷（Brdu，美国Sigma 公司）；心肌肌钙蛋白I（cTnI）抗体（武汉博士德公司）；Strept Actividin-Biotin Complex（SABC-FITC，小鼠IgG）（武汉博士德公司）；腺苷三磷酸（ATP）检测试剂盒（瑞士罗氏公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成）；逆转录试剂盒（美国Invitrogen 公司）；扩增试剂盒（美国Invitrogen 公司）；0.4%台盼蓝（华美生物工程公司）；Opti-MEM 培养基（美国Gibco 公司）；辅酶（能气朗）Q10 片（Coenzyme Q10）（卫材(中国)药业有限公司，10 mg/片）；参附益心方（SF，山东步长制药有限公司），1 g 浸膏≈9.5 g 生药，参附益心方浸膏得率10.5%。

2 方法

2.1 药液制备（现用现配）

2.1.1 参附益心方药液制备

参考相关文献[8]，电子分析天平称取SF 浸膏干粉0.25 g，添加DMEM 培养液10 ml，吹打混匀，过滤器（0.22 μm）用于过滤和去除细菌，制成参附益心方母液（25 mg/ml）。

2.1.2 辅酶Q10药液制备

取辅酶Q10 片5 片，研磨压碎，加入5.8 ml DMEM培养基，用过滤器（0.22 μm）过滤，制成辅酶Q10 母液（1×10-2mol/L）。

2.2 原代心肌细胞的分离

取1-3 d 的SD 乳鼠，无菌条件下开胸取乳鼠心脏，弃去心房与心耳部位，获得心室部分，预冷PBS 缓冲液冲洗干净后将其剪成组织块（大小约1-2 mm3）。添加心肌细胞消化液后移至玻璃瓶中，放入37℃水浴锅中，振荡水浴6 min，多次消化，直到组织块变为白色透明（约7-8次），第一次消化后，自然沉淀，去上清，之后自然沉淀后留取上清。向上清液中加入相同量含10%FBS+DMEM 培养液后轻轻吹打制成细胞悬液，离心（1000 r/min）10 min。弃去上清，加入适量10%FBS+DMEM 培养基，吹打混匀，200 目筛网过滤，获得细胞悬液。

2.3 原代心肌细胞的培养

取“2.2”细胞悬液，种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱，差速贴壁法1.5 h，抽出上清液，1000 r/min 离心5 min 后，弃上清得到心肌细胞，加入含10%FBS + DMEM 培养液吹打混匀，台盼蓝染色计算细胞数目，调整细胞浓度为4×105个/mL，接种于培养板，加入BrdU（0.1 mmol/L）抑制成纤维细胞的增殖。培养48 h，弃去上清液，加入DMEM 培养液，无血清同步化24 h。

2.4 原代心肌细胞的鉴定

培养3 d 后，弃培养液，加入4%多聚甲醛固定（10～20 min），滴加cTnI 多克隆抗体（兔多克隆抗体1∶50），4℃冰箱中孵育过夜。SABC-FITC 标记二抗（羊抗兔1∶100）避光孵育2 h 后，DAPI 染料避光5 min，水溶性封片剂封孔，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。取拍照视野6 个，镜下计数细胞总数为（N1），计数荧光阳性细胞数作为心肌细胞数(n1)，根据公式：心肌细胞比例=n1/N1×100%。

2.5 CCK-8筛选药物最合适浓度

将心肌细胞接种在96孔细胞板上，培养48 h后，无血清同步化24 h，分为Normal组、SF（参附益心方）组（浓度分别为0.1 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml）、Coenzyme Q10 组（浓度分别为1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L），培养24 h 后，更换新鲜培养基，并且每孔加入CCK-8 试剂10 ul，CO2培养箱中避光孵育2 h，酶标仪检测OD值（λ=450 nm）。

2.6 建立缺氧模型

提取的原代心肌细胞在常氧条件下放置48 h，无血清同步化24 h，各缺氧组中加入YoYo-1 染料2 ul，通过惰性气体法制造心肌细胞缺氧模型，液氮罐供气，使得温箱气体成分调整为90%N2、5%O2、5%CO2，经过长时间细胞动态成像分析系统分析后，检测每组活细胞个数，最终确定最合适的缺氧时间为6 h。正常组氧含量正常。

2.7 实验分组及干预方法

确定各组最合适浓度及缺氧时间后，取“2.3”中培养成的原代心肌细胞，每孔中加入含10%FBS +DMEM 培养液2 mL，然后对细胞进行分组，即Model组、Normal 组、Coenzyme Q10 组（1 × 10-4mol/L）、SFL组（0.25 mg/mL）、SFH 组（0.5 mg/mL）五组，置于5%O2、5%CO2、90%N2条件下培养6 h，进行缺氧损伤（正常组除外）。

2.8 试剂盒检测原代心肌细胞ATP含量

采用荧光素酶发光法，通过酶标仪检测心肌细胞中ATP 的含量，前期处理方案及分组同“2.7”，给药和造模后，将上清液吸出丢弃，用PBS 在室温下洗涤2-3次，每次1 分钟，严格按照三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒的规定操作。

2.9 试剂盒检测原代心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）含量

具体步骤如下：2 μmol/mL 丙酮酸标准品用双蒸水稀释制作标准曲线，样品孔中分别加入20 μl 样血清，25 μl底物缓冲液(含0.3 M 乳酸），对照孔以蒸馏水替代血清，37℃孵育15 min，然后加入25 μl的2,4二硝基苯肼溶液（1 mM），37℃孵育15 min，然后加入氢氧化钠溶液（0.4 M），混匀，室温孵育5 min，酶标仪上测定OD 值（λ=420 nm）。代入标准曲线拟合公式，计算乳酸脱氢酶含量。

2.10 RT-PCR 检测线粒体ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表达

前期处理方案及分组同“2.7”，缺氧条件培养6 h，RNA 提取 试剂盒 提取RNA，1 ug 总RNA 逆转 录 为cDNA，GAPDH 为内参，20 ul 体系扩增线粒体ND-1、ND-2、COX、tfam 基因，反应条件为：首先进行90 s 的95℃预变性后进行PCR 循环，然后进行10 s 的95℃变性，30 s 的60℃退火，共循环40 次。扩增结束后，缓慢加热升温，从65℃至95℃，建立关于PCR 的产物溶解曲线。2-ΔΔCT法计算各组基因的相对含量，具体各引物序列如下：ND-1 序列：上游引物：CTACATACAACTACGCAAAGGC，下游引物：GCTTAGAGCTAGTGTAAGGGAG，扩增 长 度166；ND-2 序 列：上 游引 物：TACCCGAAGTCACCCAAGGA，下游引物：GGCGCCAACAAAGACTGATG，扩增长度155；COX 序列：上游引物GTCTTGTTTGCTTTCTTTGC，下游引物：GGTACTGTCGTTCCAGACTATC，扩增长度：142；tfam 序列：上游引物：GTCAGCCTTATCTGTATTCCGA，下游引物：ACTTTTGCATCTGGGTGTTTAG，扩增长度131；GAPDH序列：上游引物：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游引物：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，扩增长度252 bp。2.11 用SPSS19.0 软件对所有实验结果进行统计分析，实验数据以xˉ±s表示，P＜0.05 提示数据的变化趋势有差异性，P＜0.01 提示有显著差异性。组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 原代心肌细胞的鉴定

此次实验以山羊抗大鼠cTnI 作为一抗、采用免疫荧光法检测鉴定原代心肌细胞的纯度。使用差速贴壁法1.5 h 后，继续培养48 h，镜下观察原代心肌细胞呈星形或者梭形交织聚集生长，融合成单细胞层，局部致密区形成细胞簇，可见同步化搏动。cTnI 一抗荧光染料细胞胞质染色均匀，纯度达标（85%），符合细胞实验要求，具体数据参照前期本团队发表文章[9]。

3.2 参附益心方对原代心肌细胞活性的影响

结果显示，0.1、0.25、0.5 mg/mLSF 组细胞活性与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；0.75、1.0、1.5 mg/mLSF 组可使细胞活性明显下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）证明此浓度范围对心肌细胞产生毒副作用。基于此浓度摸索，之后选择SF浓度为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL进行后续实验。

表1 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞LDH含量的影响(± s)

表1 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞LDH含量的影响(± s)

组别正常组模型组辅酶Q10组LDH，mU/ml 93.10±2.79 418.75±30.18 109.51±15.37组别参附益心方低剂量组参附益心方高剂量组LDH，mU/ml 167.66±18.41 116.87±9.12

图1 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞LDH含量的影响

3.3 Coenzyme 10对原代心肌细胞活性的影响

结果显示，1×10-3mol/L Coenzyme 10组细胞活性与对照组相比，细胞活性增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L Coenzyme 10 组细胞活性与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；基于此浓度摸索，选择Coenzyme 10 浓度1 ×10-4mol/L组进行后续实验。

3.4 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞ATP 含量的影响

前期结果表明，缺氧条件下原代心肌细胞ATP 含量与正常组相比明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与Model 相比，SFH 组、辅酶Q10 均可提高缺氧条件下原代心肌细胞ATP含量（P＜0.01）。具体数据参照前期本团队发表文章[10]。

3.5 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）含量的影响

结果表明，缺氧条件下原代心肌细胞LDH 含量与Normal 组相比明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；参附益心方、辅酶Q10 均可降低缺氧条件下原代心肌细胞LDH含量，与Model组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1、图1。

3.6 缺氧条件下参附益心方对mtDNA 相关基因表达的影响

缺氧条件下，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表达与其他各组相比明显降低，与Normal 组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。SFH组、辅酶Q10组ND-1基因表达可见明显升高，与Model组相比，具有统计学意义（P＜0.05）；SFH 组、SFL 组、辅酶Q10 组ND-2 基因表达可见明显升高，与Model组相比，具有统计学意义（P＜0.05）；SFH组、SFL组、辅酶Q10组COX基因表达可见明显升高，与Model组相比，具有统计学意义（P＜0.05）；SFH 组、SFL 组、辅酶Q10 组tfam 基因表达与Model组相比，无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨论

线粒体是细胞的能量工厂，在能量生产过程中发挥着重要作用。人类线粒体DNA 包含16569 对碱基，编码基因37 个，其中有13 种编码呼吸链复合体和ATP 合成酶，包含NADH 脱氢酶亚基1（ND-1）、NADH脱氢酶亚基2（ND-2）、环氧化酶（cycloxygenase，COX）等，它们是氧化磷酸化、电子传递链和ATP 合成的重要部分，其基因的突变或者表达的下降，都会影响呼吸链复合体I 酶活性降低，细胞内ATP 合成减少[11-13]。COX 基因对于线粒体呼吸链而言非常重要，是其重要组成部分之一，对ATP 的产生和功能意义重大[14]，ND-1、ND-2 不仅是线粒体DNA 的编码基因，也是NADH脱氢酶的一个亚单位，而NADH 是线粒体呼吸链的起始酶和标志物，线粒体内ATP 大多数是经过NADH 的电子传递产生[15]，故线粒体DNA 相关因子ND-1、ND-2、COX 基因在ATP 合成、能量代谢中的作用至关重要，其表达水平可以反映出线粒体能量代谢的水平[16]，研究其表达对研究心衰治疗药物的作用靶点亦具有重要的意义。此外，线粒体转录因子A（tfam）是一种核基因编码的DNA 结合蛋白。tfam 基因不仅有助于维持线粒体DNA的结构，改善线粒体损伤[17-19]，同时也参与氧化磷酸化及ATP 的合成，研究发现，tfam 对mtDNA 的转录、数量、功能维持起关键作用[20]，其表达水平的提高，能促进线粒体的合成和数量，从而促进ATP 的合成[21]。综上所述，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因的表达水平的改变可以反映出SF 对线粒体能量代谢的影响。乳酸脱氢酶是参与糖酵解和糖异生的重要酶，心力衰竭时心肌细胞处于缺氧状态，LDH 代偿性增加，通过糖无氧酵解以代偿性产生ATP 维持心肌细胞能量[22]。

图2 缺氧条件下参附益心方对原代心肌细胞ND-1、ND-2、COX、tfam基因表达的影响

祖国医学没有“心衰”病名，但其临床症状似属中医典籍水肿、喘症、心悸、胸痹范畴，且对此早有描述，如《金匮要略》：“心水者，其身重而少气，不得卧，烦而燥，其人阴肿”明确的说明其病理因素为“水”。另外，已有前期实验证实西方医学中“ATP”“能量”与祖国医学之“气”具有相似的理论与物质基础[4]，心衰患者ATP 合成减少，心肌细胞能量匮乏，从而造成心脏储备力耗竭，中医典籍《伤寒明理论》言：“其心气虚者，由阳气内弱，心下空虚，正气内动而为悸也”对心衰的症状做了描述，且指出其“心气虚”，与ATP 合成减少、能量匮乏不谋而合。参附益心方是河南名医孙建芝教授的临床经验方，配伍精良，选方得当，其具体成分为人参、附子、桂枝、丹参、赤芍、益母草、猪苓、泽泻、葶苈子、砂仁、大枣，经前期研究此方辩证立足于心气虚[23]，方中君药为人参，具有补益心气的功效，从西方医学来说，人参能改善心肌细胞的能量代谢，增加ATP 含量。参附益心方总括于阴阳，参之以“水”“淤”等病理因素，以活血化瘀、益气温阳、利水消肿为治法，对于心衰患者效如桴鼓。

经过前期临床研究和实验研究发现，心衰时心肌收缩力降低，心脏输出量减少，缺血缺氧的病理状态使得心衰症状加重，而参附益心方可以增加心肌收缩力、增加ATP 合成，以保护心肌细胞，减轻心力衰竭症状[5-7]。本次实验目的在于探究缺氧条件下参附益心方对心肌细胞线粒体DNA 基因的表达作用。实验结果显示：与Normal 组对比，Model 组ATP 合成减少，LDH 合成增加，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表达下降，说明缺氧条件下，原代心肌细胞线粒体内相关基因表达下降，ATP 合成减少，能量代谢障碍；与Model组对比，SF 组可提高大鼠心肌细胞ATP 含量，降低LDH 含量，增加ND-1、ND-2、COX 基因的表达，因此参附益心方可能通过作用于心肌细胞线粒体的基因表达，来提高ATP的合成，降低LDH 合成，以保护心肌细胞，稳定线粒体膜电位，对缓解心衰患者临床症状与维持心肌细胞能量代谢意义重大。