糖尿病肛瘘LncRNA芯片分析及CNC图搭建＊

黄 俊，李心甜，马 乐，耿越飞，沈咏梅，曾娟妮

（1. 湖南中医药大学，长沙 410208；2. 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；3. 药用美洲大蠊四川省重点实验室，成都 610000；4. 湖南中医药大学第二附属医院，长沙 410005）

肛瘘是在肛肠疾病中十分常见，主要是因为感染、损伤等导致肛管直肠与肛周皮肤相通的异常管道，其一般无法自愈，保守治疗只能暂时缓解患者痛苦，但容易反复发作，而手术治疗是根治肛瘘的主要方式之一。但是因为其发病部位比较特殊，术后创面容易污染，伤口感染概率较大，若加之合并糖尿病，则会增加创面感染概率，延长愈合时间，甚至迁延不愈，形成慢性难愈合创面。因此，积极促进肛瘘创面的愈合是我们研究的重点。LncRNA（longnon-codingRNA）是长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，定位在细胞核或细胞质中，不被翻译为蛋白质，早前被认定为是基因组转录的副产物[1,2]。随着近年来，对于LncRNA研究越来越多，其功能也被逐渐发现。目前研究认为，LncRNA 在生命过程中扮演着重要角色，对多种生理及病理过程都有调节作用，LncRNA 表达的异常，是多种疾病（如糖尿病、癌症等）的发生、发展的重要原因[3-6]，近几年也有研究提出其亦参与创面愈合的调控。随着国内外对LncRNA 认识的逐步加深，本项目旨在对糖尿病肛瘘创面差异表达LncRNA 基因芯片表达谱的基础上，建立LncRNA 与mRNA 之间调控网络并研究关键LncRNA 的作用机制，从而探讨慢性难愈合创面的发病机制，为开发促愈药物提供基础研究。

图1 差异LncRNA 及mRNA 的箱体图、散点图

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 一般资料

实验组样本选自3例收治于湖南省中医院肛肠科的复杂性肛瘘合并2 型糖尿病患者，对照组样本来源于湖南省中医院肛肠科收治的3 例复杂性肛瘘患者，术中均用双氧水、生理盐水清洗伤口后，络合碘消毒，待创面新鲜肉芽长出，用组织剪剪除创面中央直径约0.5 cm肉芽，立即放入标本管并放于干冰中冻存，随后立即将标本交于上海康成生物工程有限公司代为保管；标本记录本上仔细登记患者信息；待标本收集完后由上海康成生物工程有限公司应用Arraystar 人类LncRNAV4.0版芯片完成长链非编码RNA表达谱的检测。本研究获得湖南中医药大学医学伦理委员会的批准，并将其目的及风险告知受试者，由受试者签署同意书。

1.1.2 诊断标准

1.1.2.1 肛瘘诊断标准参照国家中医药管理局行业标准及中华中医药学会肛肠分会肛瘘诊断标准[7]，复杂性肛瘘：管道有2条以上，位于肛管直肠环以上，且有2个以上外口或内口。

1.1.2.2 2 型糖尿病诊断标准参照《中国2 型糖尿病防治指南（2017年版）》制定[8]：临床症状：典型的“三多一少”症状，即多食、多饮、多尿和体重下降；2、实验室检查：空腹血糖＞7.0 mmol/L 或餐后两小时血糖＞11.1 mmol/L。无上述症状的患者需再次检查。

图2 差异mRNAs 的KEGG 通路图

1.1.3 纳入标准

①符合上述复杂性肛瘘诊断标准；②符合上述2型糖尿病的;③签订知情同意书并配合观察的患者。

1.1.4 排除标准

①低位肛瘘或1 型糖尿病患者；②合并有其他肛肠疾病者；③合并其他慢性肠道疾病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎患者；④孕妇及哺乳期妇女；⑤近期用抗凝药物或搭有心脏支架患者。

1.2 微阵列芯片技术检测lncRNA

1.2.1 总RNA提取和质量控制

标记RNA 前使用Agilent ND-1000检测RNA 是否降解并检测RNA浓度。

1.2.2 标记和杂交

Arraystar RNA Flash Labeling Kit 对样品进行标记，芯片杂交实验使用Agilent SureHyb进行。

1.2.3 数据采集和标准化

芯片经过洗涤后，应用Agilent DNA Microarray Scanner 扫描。使用Agilent Feature Extraction 软件（v11.0.1.1)获得采集芯片探针信号值。使用软件Agilent GeneSpring GXv12.1进行标准化。

1.2.4 差异表达分析和功能分析

挑选差异表达LncRNA 和差异表达mRNA 的软件为Agilent GeneSpring GXv12.1 软件。筛选标准为2 倍差异及P ＜0.05，再进行差异表达分析，然后对差异表达的mRNAs 进行KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，挑选出显著mRNA 指标，将这些显著mRNA 指标进行q-PCR 验证，得到有意义的阳性指标，将这些阳性指标与差异LncRNA 交集得出LncRNA-mRNA 共表达网络，并基于LncRNA-mRNA 共表达网络挑选出不同LncRNA进行功能验证。

2 结果

2.1 将芯片标准化后，筛选基准为2 倍差异及P ＜0.05 进行差异表达分析，发现二组有19871 个无差异lncRNA，上调差异有502 个，下调差异有1204 个；mRNAs 分析发现二组有16485 个无差异，上调差异621 个，下调差异505 个。其具体箱体图及散点图见图1。

图1 为长链非编码RNA 及mRNA 的箱体图、散点图。箱体图显示检测之后的LncRNA（A）及mRNA（B）在分布情况上趋于一致。（C）图红色为在糖尿病肛瘘术后创面表达上调2 倍的LncRNA，绿色为下调2 倍的长链非编码RNA（P ＜0.05）。（D）红色部分为在糖尿病肛瘘术后创面中表达上调2 倍的mRNA，绿色部分为下调2倍的mRNA。

2.2 对差异表达的mRNAs 进行KEGG 通路分析（见图2）

图2 为差异表达的mRNAs 的KEGG 通路分析：A为在糖尿病肛瘘术后创面中下调的10条通路分别是：细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）、阿 米 巴 病（Amoebiasis-Homo sapiens）、调节干细胞多能性的信号通路（Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells-Homo sapiens）、肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system-Homo sapiens）、JAK STAT信号传导途径（Jak-STAT signaling pathway-Homo sapiens）、癌 症 的 途 径（Pathways in cancer-Homo sapiens）、TGF-β 信号通路（TGF-beta signaling pathway-Homo sapiens）、哮喘（Asthma-Homo sapiens）、AGERAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications-Homo sapiens）、炎症性肠病(IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens），其中下调最明显的是细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）；B 为在糖尿病肛瘘术后创面中上调的前10 条通路，分别是：破骨细胞分化（Osteoclast differentiation-Homo sapiens（human））、利什曼病（Leishmaniasis-Homo sapiens（human））、肺结核（Tuberculosis-Homo sapiens (human)）、金葡菌感染（Staphylococcus aureus infection-Homo sapiens（human））、吞 噬 体（Phagosome-Homo sapiens（human））、抗原处理及呈递（Antigen processing and presentation-Homo sapiens（human））、自然杀伤细胞细胞毒活性（Natural killer cell mediated cytotoxicity-Homo sapiens（human））、类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis-Homo sapiens（human））、移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease-Homo sapiens（human））、炎症性肠病（IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens（human））、同种异体移植排斥反应（Allograft rejection-Homo sapiens（human）），上调最明显的是破骨细胞分化（Osteoclastdifferentiation）通路。

图4 内参校正图

2.3 基于上述KEGG通路分析的Pathway Map展示

基于上述KEGG 通路分析，下调最明显的Cytokine-cytokinereceptorinteraction，上调最明显的是Osteoclast differentiation 通路，分别将其进行Pathway Map展示（见图3）。

A 为糖尿病肛瘘术后创面中下调最明显的Cytokine-cytokinereceptorinteraction-Pathway 展示图，黄色代表有影响意义指标，有：CCL26、IL6、LIF、IL13、CSF2、IL5、HGF、IFNB1、IL2&RA、SF21、SF19、BMP2；B为糖尿病肛瘘术后创面中上调最明显的Osteoclast differentiation-Pathway 展示图，橙色代表有影响意义指标，有：IFNy、c-Fms、IFNGR、Ig-like R FcRy、Ig-like R DAP12、STAT1、PI3K、MKK6、NADPH、STAT1/2、AP1、CTSK、c-Fos。

2.4 对8个最有影响意义的指标行q-PCR验证

基于上述对mRNA 的KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，从中挑选8 个指标（BMP2、IFNB1、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7、SMAD9、β-actin）进行q-PCR验证，以β-actin 作为内参标准，从而得到内参校正图（图4）。

从上图4 可以了解到，BMP2、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7 的P 值小于0.05，说明这5 个基因有统计学意义，再结合芯片标准化后结果，这5个基因与基因标准化结果趋势一致，表示这5 个基因为阳性，说明这5 个基因指标有意义。

2.5 LncRNA-mRNA共表达网络图

将Q-PCR 验证得到的5 个有意义的mRNA 指标与相应的LncRNA 进行关系分析，从而得到LncRNAmRNA共表达网络图（图5）。

图5 LncRNA与mRNA基因共表达网络图

红色标记为LncRNA；蓝色标记为mRNA。正相关为实线，负相关为虚线。

2.6 基于LncRNA-mRNA的CNC图分析

IL6 和IL18 在促进创面修复方面具有重要作用。IL6 是一种细胞因子，可由多种细胞诱导产生，并能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能，所以IL6 涉及多种炎症相关疾病，包括糖尿病和系统性幼年类风湿性关节炎；而IL18 属白介素-1 家族，是一种前炎症细胞因子，可促进释放炎性细胞因子，并调节其相互之间的作用关系，所以对于机体内炎性反应具有强大调节的作用[9]。结合LncRNA-mRNA 共表达网络图，选取20 个LncRNA 指标:NR_125383、T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、ENST00000418393、 TCONS_00017190、 TCONS_00019532、 ENST00000601559、 ENST00000566575、NR_109882、 NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747（选取 标准 为PCC 绝对值值较大且长度不超过2000），其中:NR_125383、 T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、 ENST00000418393、 TCONS_00017190、TCONS_00019532、 ENST00000601559、ENST00000566575、NR_109882 和IL6 有明显相关性，NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747 和IL18 具 有 明显相关性，说明此20 个LncRNA 或正或负影响着IL6或IL18，从而影响着创面的修复。同时我们发现该20个LncRNA 此前在不同领域中均有不同程度的报道，如ENST00000418393 通过调控HTERT 来调控胃癌细胞[10]、ENST00000580756 与血管畸形导致中风有关[11]，ENST00000566575 与肝内胆管细胞癌、胸主动脉瘤、鼻咽癌、青少年特发性脊柱侧凸等有关[12-15]，NR_026913 与小细胞癌有关[16]，但在创面愈合及炎症反应中的报道相对较少，说明这些相关LncRNA 仍有许多功能暂未得知，需要我们进一步探讨，为后续的功能和机制研究提供了方向和重点，为加速慢性难愈合创面愈合的研究提供了新的思路，为开发促愈药物提供基础研究。

3 讨论

最初，LncRNA 被认为是基因组转录的“噪声”，不具备任何生物学功能，但越来越多的LncRNA 被识别并发现在基因转录的生物功能中发挥重要的调控作用，吸引了大量的关注，随之也成为研究热点，至今，已有超过12000 的LncRNAs 被收录在人类基因组中。近年来，对于LncRNA 的研究越来越多，其中对于炎症性疾病的研究比比皆是，比如洪宏海[17]等人发现，LncRNA-MT1JP 受到干扰后，关节滑膜细胞MH7A 的炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-8 表达水平明显上调，同时该研究还发现MT1JP 可以调控p53 蛋白水平，表明MT1JP 可能通过调控p53 蛋白水平从而调控炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8在关节滑膜细胞中的表达，进一步抑制类风湿性关节炎的炎症反应。周彩兰[18]等人发现LncRNANONHSAG057461.1 在被PM2.5 干扰后，可以抑制炎症因子IL-1β 的表达，同时还发现当用NFκB阻断剂BAY11-7082 后，LncRNA-NONHSAG057461.1的 转 录 水 平 明 显 降 低 ，说 明 LncRNANONHSAG057461.1 本 身 可 能 受TLR2/MyD88/NFκB通路的调控。同时lncRNA 还在人类多种疾病当中都具有调控作用，如克罗恩病，前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等[19-22]。

本研究应用微阵列芯片技术观察lncRNA 与mRNAs 在人体样本的糖尿病肛瘘创面及普通肛瘘创面的表达谱，筛选基准为2倍差异及P ＜0.05进行差异表达分析，发现上调差异有502 个，下调差异有1204个；mRNAs 分析发现上调差异621 个，下调差异505个。对差异表达的mRNAs 进行KEGG 通路分析及其上调、下调最明显的通路的Pathway Map 展示，筛选出8 个最有影响力的指标，行q-PCR 验证，得到5 个阳性基因指标，将5个阳性基因指标结合相关前期LncRNA再搭建LncRNA-mRNA 共表达网络图，根据已搭建的LncRNA-mRNA 共表达网络图，从中选取PCC 绝对值值较大且长度不超过2000 的LncRNA 共20 个，该20个LncRNA 此前在不同领域中均有不同程度的报道，为后续的功能和机制研究提供了方向和重点，为加速慢性难愈合创面愈合的研究提供了新的思路，为开发促愈药物提供基础研究。

综上，本研究在国内率先应用基因芯片技术搭建LncRNA 与mRNA 的CNC 基因网络图，从分子生物学角度，并结合现代芯片技术，了解糖尿病肛瘘的发病机制，为全面探讨LncRNA 在创面修复中的作用机制等方面提供新思路，加之近年来对LncRNA 的研究越来越深入，这将对慢性难愈合创面的治疗产生深远的影响，同时为开发促愈药物提供方法支持和思路借鉴。