NLRP3炎性小体与慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能相关性研究

陈忠仁 欧宗兴 王蕾 沈彬 梁海梅 杨绪莉 黄实仁

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)简称慢阻肺，是暴露于有害颗粒或气体后，持续的呼吸症状及气流受限的一种肺部疾病。它虽然为肺部疾病，但同时也存在持续的全身性炎症[1-2]。目前有研究以“溢出效应”解释，认为气道炎症过度表达后，“外溢”至外周使血清的炎症因子水平异常升高。但同时，外周血异常表达的炎症因子，又可刺激气道分泌炎症因子，加重气道的炎症，这就是所谓的“炎性循环”；加重的气道炎症会持续破坏气道引起气流受限，肺功能下降，证明血清炎症因子水平，与慢阻肺病情严重程度密切相关[3]。近几年，NOD 样 受 体 热 蛋 白 结 构 域 相 关 蛋 白 3(NLR family, pyrin domain containing 3，NLRP3)炎症小体作为与一种免疫相关的受体，与自身免疫疾病有着密切的联系。本研究制备慢阻肺大鼠模型，检测其肺功能、外周血IL18、IL1β水平及外周血淋巴细胞NLRP3炎性小体mRNA浓度，以探讨三者之间的关系。

资料与方法

一、一般资料

1 动物 健康清洁级 wistar 大鼠 24 只，平均体重 220～250g，由斯莱克提供。

2 主要试剂 内毒素(Sigma)；PrimeScriptTMRT reagent Kit(for real time) RR037A，SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) RR420A( TAKARA公司)；红梅牌香烟(红塔集团)。

3 主要仪器与设备 RES2020型 (AniRes2005分析系统) 北京贝兰博科技有限公司；荧光定量PCR仪(LightCycler® 96)罗氏；IL-18 ELISA 试剂盒(南京建成)、IL-1β ELISA 试剂盒(南京建成)；正置显微镜(BK-FL2)重庆奥特光学仪器有限公司；烟熏染毒箱(自制)。

二、实验方法

1 动物模型的制备及分组 采用随机数字表法将 24 只 1 月龄清洁级 wistar 大鼠随机等分成两组(性别相同)，分别为空白组、慢阻肺组。慢阻肺组参考宋一平的方法制备模型[4]。方法如下：第 1 和第 14 d经气管滴入 2000 μL(质量浓度为 1 μg/μL)内毒素，后 2～30 d(第 14 d除外)，将大鼠放入 5%香烟烟雾中熏 0.5 h/d。

2 肺功能检查 采用RES2020型 (AniRes2005分析系统)检测。将待检的大鼠用5%水合氯醛(0.7mL/100g)腹腔注射麻醉，切开大鼠颈部皮肤后，用镊子钝性分离皮下组织，暴露出气管，气管做一倒T型切口，插好管子，固定于体描箱内。设定好FVC参数，按平均体重设定潮气量。检测大鼠的用力肺活量(FVC)；0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)；肺阻力(R)；肺顺应性(Cdyn)。

3 Real-time PCR检测外周血淋巴细胞NLRP3mRNA 取大鼠外周血，分离出淋巴细胞，加入 TRIzol 提取总RNA，逆转录合成 cDNA。将获得的 cDNA 按PCR试剂盒说明书方法扩增目的基因。引物Bactin-F GGAGAAGATTTGGCACCACAC，Bactin-R ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段长度173bp。NLRP3-F AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，NLRP3-R GAGCGTCACCACACACAGAT，片段长度179bp。反应条件: 95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，共 40～45 个循环。计算 Ct 值，应用 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 采用双抗体两步夹心 ELISA 检测大鼠血清 IL-18、IL-1β 的水平，按试剂盒说明书操作，最后通过酶标仪和计算机得出细胞因子浓度 。

结 果

一、两组大鼠基本情况比较

空白组大鼠营养好，皮毛白皙有光泽，活动灵敏；而慢阻肺组大鼠在造模过程中逐渐出现营养不良，行动迟缓，精神萎靡，双目无神，反应迟钝，进食减少，皮毛枯槁发黄，触之易脱落，可见倒竖现象，口唇发绀。

二、慢阻肺组大鼠肺组织病理

光镜下可见慢阻肺组大鼠支气管上皮增生增厚，肺组织大量炎症细胞聚集，以肺泡腔为多(图1)。

图1 HE染色慢阻肺组肺组织病理(200×)

三、外周血炎症因子、外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA水平与肺功能的关系

1 肺功能 比较空白组与慢阻肺组大鼠的用力肺活量(FVC)；0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)；0.3秒用力呼气容积与用力肺活量的比值(FEV0.3/FVC)；肺阻力(R)；肺顺应性(Cdyn)的差异，结果发现(表1)：空白组与慢阻肺组的FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC差异显著(P<0.05)；空白组的肺阻力较慢阻肺组明显降低(P<0.05)；空白组的肺顺应性较 COPD 组明显增加(P<0.05)。

2 两组大鼠外周血淋巴细胞NLRP3mRNA水平比较 比较两 组大鼠外周血淋巴细胞NLRP3mRNA水平，结果发现：在慢阻肺组较空白组升高(P<0.05)，差异有统计学意义(见表1)。

表1 两组大鼠肺功能结果及外周血淋巴细胞NLRP3mRNA的表达

3 两组大鼠血清炎症因子水平比较 对比两组大鼠外周血 IL-18、IL-1β 水平差异，结果发现：在 慢阻肺 组均较空白组升高(P<0.05)，差异有统计学意义(见表2)。

表2 两组大鼠外周血炎症因子水平差异

4 两组大鼠肺功能指标与外周血淋巴细胞NLRP3mRNA浓度之间相关性分析 采用 Pearson 相关分析，用力肺活量、0.3秒用力呼气容积、0.3秒用力呼气容积与用力肺活量的比值、肺顺应性与外周血淋巴细胞中NLRP3mRNA浓度呈显著负相关(P<0.05)，而肺阻力与之为正相关(P<0.05)(见表3)。

表3 大鼠肺功能指标与NLRP3 mRNA浓度之间的相关性

讨 论

慢阻肺是一种气道慢性炎症疾病，由有害颗粒或气体诱发的炎性反应引起。除了大量的炎性细胞分布在患者肺部，患者血清炎症因子水平同样有提高[5]。同时，血清炎症因子浓度升高，可以募集大量的炎性细胞至肺组织，产生活性氧等炎性介质，产生持续的炎症反应，持续的炎症反应会使上皮细胞化生、杯状细胞增生、气道重塑，患者会出现气道分泌物增多，呼吸困难，肺功能的下降[6]。本研究中选择 IL-1β、IL-18为体液免疫中刺激机体进一步释放炎性递质的细胞因子，可以反映慢阻肺炎症反应的外溢现象[7]，有研究表明，慢阻肺在疾病过程中可诱导IL-18等因子的分泌[8-9]。作为近年来研究的热点，NLRP3炎性小体在感染性疾病和炎症性疾病中的作用日益得到重视[10]。有研究指出，NLRP3炎性小体激活后，可分泌大量的炎症因子及活性物质，参与慢阻肺疾病的发生发展。

IL-1β主要由单核巨噬细胞分泌，参与机体各类炎性反应，并与其他细胞因子相互作用， 进一步 加重慢阻肺的气道炎症反应， 而气道炎症反应又可刺激IL-1β的合成及分泌[11]。 国外学者研究结果表明IL-1β与肺功能严重程度呈正相关，可使患者肺功能下降[12]。 IL- 18作为前炎症细胞因子可诱导及增强多种细胞因子的合成、分泌及活化[13]。同样，气道炎症的增强可刺激IL-18的活性及在血清的水平。[14-15 ]NLRP3 炎性小体近来研究较为透彻，当受到内外源性的刺激后，可使效应蛋白 caspase-1 活化，致细胞因子 IL-1β、IL-18 活化和分泌[16]。

本研究采用经典的烟熏加内毒素气管滴入的方法制作慢阻肺模型，慢阻肺组的气道病理及FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、R、Cdyn等肺功能结果均表明造模成功，同时慢阻肺组的肺功能与空白组的差异有统计学意义。慢阻肺组血清的IL-18、IL-1β水平显著高于空白组，这与之前的研究相符合[17]，表明随着慢阻肺的疾病进程，慢阻肺的炎性反应开始出现失衡，外周炎症反增强。同时外周血淋巴细胞的NLRP3mRNA水平，慢阻肺组显著高于空白组。有研究表明，慢阻肺疾病进程中，炎性小体的过度表达起了重要作用[18]。也提示我们，慢阻肺患者在受到各种刺激后，可通过激活炎性小体的合成、活化，使IL-1β，IL-18等下游因子具有生物活性，使慢阻肺的炎症失衡更加严重，会造成气道壁的破坏，管腔的缩小、肺功能的下降，本研究中，NLRP3mRNA水平与大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、Cdyn呈负相关，与R呈正相关，这也提示我们，炎性小体在慢阻肺进程中起着重要作用，既往的研究也表明了这点[19]。

综上所述，血清中的炎性介质在慢阻肺肺功能恶化中起着重要的作用，而炎性小体可能是调节其的重要位点，这可能成为我们干预慢阻肺进程的靶点。但本研究为动物实验，未涉及实际慢阻肺患者，且样本量较少，缺乏干预组，使本研究具有一定的局限性。未来，可通过扩大样本量，设置干预组，并可进行临床实验，来进一步明确这些指标和慢阻肺进展的关系，以指导个体化治疗，延缓疾病进程。