黄连素调节非小细胞肺癌细胞糖酵解水平并抑制A549细胞EMT的发生

吴国成 陈焕

与正常组织细胞相比，肿瘤细胞除了具有无限增殖能力、失去接触抑制以及迁移能力外，代谢的重排也是恶性肿瘤的另一重要特征。为适应肿瘤的增殖、侵袭以及逃避机体免疫系统的杀伤等，即使在有氧条件下肿瘤细胞也会主动选择糖酵解作为获取能量的方式，即Warburg效应[9-11]。上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition， EMT) 是肿瘤细胞增强其侵袭和迁移能力的表现之一[12]。有研究表明，多种癌症类型中可见上皮细胞间质化，诱导代谢相关酶的表达和活性改变，进而影响肿瘤细胞的代谢特征[13-15]。还有研究显示，肿瘤细胞代谢相关调节酶的改变，同样可以反馈性的阻断或增强EMT效应，进而增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力并导致转移的发生[16-18]。

本研究旨在探讨BBR对肺肿瘤细胞A549的增殖和侵袭能力的影响，并探索BBR抑制A549细胞侵袭迁移的相关机制。

材料与方法

一、实验试剂

纯度大于99%的BBR购自TCI化成工业发展有限公司(中国上海)。CCK8细胞活性检测试剂盒购自Dojindo(日本)。 Anti-Vimentin (Proteintech, cat# 10366-1-AP); Anti-E-cadherin (Proteintech, cat # 60335-1-lg; 1 ∶1000); Anti-N-cadherin (Proteintech, cat #22018-1-AP; 1 ∶1000); Anti-β-catenin(CST, cat #8480; 1 ∶1000)；Anti-Fibronectin(Abcam, cat #ab32419; 1 ∶1000)；Anti-HK2 (CST, cat #2867; 1 ∶1000); Anti-Glut1 (CST, cat #12939S; 1 ∶1000); Anti-β-actin (CST, cat #3700; 1 ∶10000)；Matrigel (Corning, cat #356234)。

二、实验方法

1 CCK8细胞活性检测：CCK8细胞增殖活性检测操作步骤如说明书所述。大致步骤如下：96孔板中每孔加入含3000个细胞的细胞悬液100μl，继续培养24h；细胞贴壁后加入不同浓度的BBR孵育3 d；每孔加入10ul CCK8试剂并孵育40 min左右；酶标仪测量OD值。

2 细胞迁移实验：本实验采用8μm孔径的Transwll小室(Corning)。上室中加入5×104的细胞悬液，下室中加入含血清的完全培养基以促进细胞移动。常规培养(37℃，20% O2, 5%CO2)24h后，使用棉签擦拭掉未透过小室的细胞。1%结晶紫染色，使用光学显微镜(Olympus)拍摄图像。随机选择3张50倍放大图像，使用ImageproPlus软件对迁移的细胞数量进行统计分析。

政府早已认识到儿科医护人员的巨大人才缺口,开始从各个方面增加儿科医护人员配置,对于加强儿童医疗卫生服务提出了多方面的建议:儿科医护人员国家免费培养;提高儿科医护人员收入水平,健全以服务质量、数量和患者满意度为核心的内部分配机制,做到优绩优酬、同工同酬,确保儿科医务人员收入不低于本单位同级别医务人员收入平均水平;新改扩建儿童医院,新增儿科床位,建立健全功能明确、布局合理、规模适当、富有效率的儿童医疗卫生服务体系;加强儿科医务人员队伍建设,增加每千名儿童儿科执业(助理)医师数等等。采用各种方式变相增加儿科医护人员编制,减轻儿科医护人员工作量。

3 细胞侵袭实验：10 ∶1稀释Matrigel基质胶，铺设于上室底部，待基质胶凝固后加入2×105的细胞悬液。室中加入含血清的完全培养基以促进细胞移动。常规培养(37℃，20% O2, 5%CO2)48h后，使用棉签擦拭掉未透过基质胶的细胞。1%结晶紫染色，使用光学显微镜(Olympus)拍摄。随机选择3张50倍放大图像，使用ImageproPlus软件对侵袭的细胞数量进行统计分析。

4 划痕实验：6孔板中每孔加入1×105的A549细胞，正常培养24 h后，待细胞完全贴壁且生长密度至80%～90%左右，更换无血清培养基。在细胞间划出0.5 mm宽的间隙，光镜(Olympus)拍摄。常规培养(37℃，20% O2, 5%CO2)24h后再次拍摄，对比观察细胞迁移情况。

5 免疫印迹实验：提取对照组及BBR处理组A549细胞蛋白，Western Blot检测N-cadherin、E-cadherin、Vim、Fibronectin、β-catenin、HK2等蛋白的表达水平。

6 RT-PCR：RNA快速提取试剂盒提A549细胞RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 试剂盒进行逆转录。按照SYBR RT-PCR Kit 说明书要求，配制定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR下检测AIM2和CASPI基因表达水平。记录并保存Real-time PCR扩增基因片段的扩增曲线和解链曲线。

7 代谢通量测定： 胞外产酸率(extracellular acidification rate, EACR)使用Seahorse XF96 细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience) 检测，ECAR的单位为mph/min。

结 果

一、不同剂量的BBR对A549细胞增殖活性产生不同的影响。

CCK8实验检测A549细胞在4μmol/L～64μmol/L浓度的BBR作用下增殖活性的变化(图1)。结果显示，较低剂量的BBR(4μmol/L、8μmol/L)具有轻微的促进A549细胞增殖活性的能力(P<0.05)，高剂量BBR(32μmol/L、64μmol/L)能够显著抑制A549的细胞增殖能力(P<0.05)。因低剂量BBR具有促进肺癌细胞增殖的能力，而高剂量的BBR表现为细胞增殖抑制活性，因此后续研究选择高剂量BBR作为干预组，研究BBR对A549细胞迁移侵袭能力的影响，从而整体的探讨应用BBR使肺癌患者获益的可能性(包括抑制肿瘤细胞增殖和迁移)。同时，与32μmol/L的BBR组相比，64μmol/L的BBR对A549细胞增殖能力的影响未见显著差异(P>0.05)，因此选择32μmol/L的BBR作为后续研究迁移实验的主要浓度。

图1 BBR作用下A549细胞增殖活性

二、高剂量BBR显著抑制A549细胞侵袭和迁移能力。

为进一步了解黄连素对肺癌转移的作用，我们进一步展开了侵袭和迁移实验(图2)。结果显示，高剂量BBR(32μmol/L)能够显著降低A549细胞迁移和侵袭的能力(P<0.05)。

图2 高剂量BBR抑制A549细胞侵袭和迁移

三、BBR抑制A549细胞发生EMT。

使用Western blot检测高浓度BBR作用下A549细胞内EMT相关蛋白的表达变化(图3&表1)。结果显示，与对照组相比，高浓度BBR作用组间质标记物N-cadherin及Vimentin等蛋白的表达显著下降，(P<0.05)，差异有统计学意义。

表1 不同浓度BBR对A549细胞增殖能力的影响

图3 高剂量BBR抑制A549细胞发生EMT

四、BBR显著下调A549细胞糖酵解水平

大量研究显示肿瘤细胞的代谢重排是肿瘤细胞适应自身增殖和转移需求的表现之一。我们进一步检测了BBR对A549细胞糖酵解相关酶的表达转录情况,结果显示，BBR能够下调A549细胞内以HK2为主的糖酵解活性酶的基因水平(P<0.05)。代谢通量检测结果显示，高剂量BBR作用下，A549细胞葡萄糖有氧氧化水平下调，胞外产酸率显著增加(P<0.05)，提示高剂量BBR抑制了A549细胞的糖酵解水平。而使用重组HK2能够阻断BBR对A549糖酵解水平的抑制(图4)。

表2 高剂量BBR对A549细胞侵袭和迁移能力的影响

图4 BBR显著下调A549细胞糖酵解水平

五、BBR通过调节A549细胞糖酵解水平抑制A549细胞侵袭和迁移

为明确BBR对A549细胞糖酵解水平的调节与抑制A549细胞EMT之间的关系，我们进一步检测了HK2的应用对BBR作用下A549细胞侵袭和迁移能力的影响(图5)。结果显示，HK2能够显著阻断高剂量BBR对A549细胞侵袭和迁移活性的抑制作用(P<0.05)，差异有统计学意义。

图5 BBR通过调节A549细胞糖酵解水平抑制A549细胞侵袭和迁移

表3 高剂量BBR对A549细胞内EMT相关蛋白表达水平的影响

讨 论

肺癌的转移是指肿瘤细胞从肺部原发病灶脱落并扩散到肺内其他部位或远处器官的过程，在肺癌相关死亡率中占90%以上。肺癌转移的过程十分复杂，涉及原发肿瘤灶侵袭周围组织，癌细胞脱落后入侵进入微血管，通过血液或淋巴管进行迁移，种植于机体远处器官或组织并继续增殖，最终形成继发性肿瘤灶[19-20]。因此，充分了解控调节肺癌转移的基本机制，发现可用于癌症治疗的肿瘤细胞弱点至关重要。

EMT是一个活跃于胚胎发生和组织修复的跨分化过程，被认为是肿瘤发生和转移扩散进程中的关键环节。在EMT过程中，上皮细胞失去了细胞与细胞，细胞与间质之间的连接结构和相互作用，上皮细胞特征逐渐消失，并获得更多的间质特性。发生EMT的细胞形态、行为发生改变，E-cadherin、β-catenin等上皮标记表达降低；细胞Vimentin、N-cadherin及Fibronectin表达显著上调，运动能力和侵袭能力均显著增加[21]。在肿瘤发生发展的背景下，EMT代表了一系列重要的表型和信号的改变，反映了肿瘤细胞从快速增殖到维持存活和转移的需求转变。因此，为了支持新的细胞状态，该过程必然伴随着细胞代谢程序的重新编辑。

葡萄糖是维持细胞生存和生命活动的主要能量来源。大多数肿瘤细胞获取ATP的方式与正常组织细胞不同。在常氧条件下，肿瘤细胞会优先选择糖酵解途径，而不是选择能量效率更高的葡萄糖氧化磷酸化途经，这一现象被称为Warburg效应。尽管Warburg效应的能量效率较低，但其从分解葡萄糖开始到产生ATP的路径更短，同时能够获取大量的糖酵解产物，如乳酸以及其他有利于肿瘤细胞生长、存活和转移的蛋白质、核酸、脂质和其他生物大分子[22]。

研究表明，肿瘤细胞的代谢重排与EMT过程及肿瘤的转移密切相关[12,18]。本研究中，我们发现高浓度BBR可以通过抑制A549细胞EMT的发生从而发挥抑制肿瘤侵袭和转移的作用。有趣的是，我们还注意到高浓度BBR抑制A549发生EMT可能是以调节细胞代谢水平的方式实现的。应用BBR后，A549细胞的ECAR和OCR明显降低，细胞的糖酵解水平受到抑制。PCR结果显示BBR显著下调HK2及LDHA基因表达，使用重组己糖激酶HK2能够显著阻断黄连素对EMT的抑制作用，提示BBR抑制A549细胞EMT的发生是HK2依赖的。

综上所述，本研究结果显示BBR具有出色的抑制肺癌A549细胞侵袭和转移的功效，并揭示了该进程的相关机制，为肺癌的治疗提供了新的理论依据和实验基础。