五苓散对肾阳虚型口干燥症小鼠颌下腺AQP-5的分布表达研究∗

陈丽莹 王洁宜 朱潇莹 倪哲婷 江诗梦 王新昌

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省新华医院，浙江 杭州 310005）

口干燥症是指口腔干燥以及口腔功能的丧失，具体可由衰老、药物使用不当、头颈部恶性肿瘤的放射治疗以及干燥综合征等相关因素引起。老年群体是口干燥症的高发群体，是虚证的常见症状，阳虚质在老年偏颇体质中所占比例较高［1］。中医认为，在老年患者群体中，阳气无法推动津液在人体表里上下的输布，可导致“消渴”“烦渴”等症状的出现，五苓散对治疗口干燥症颇有疗效。同时，现代医学表明，水孔蛋白-5（AQP-5）和口干燥症有着紧密的联系，它是一种主要分布在唾液腺中的跨膜通道蛋白，具有水渗透性特征。正常情况下，它存在于细胞内囊泡内，在受到体内外某些刺激后，出现由囊泡向细胞顶膜“转位”的现象，从而促进了唾液腺的正常分泌。目前尚未有关于应用五苓散改善口干燥症机制的研究，故本实验从中医化气布津的治则出发，假设五苓散能通过调控AQP-5分布表达治疗肾阳虚型口干燥症小鼠，以此并展开研究讨论，为从现代医学角度解释五苓散治疗老年患者肾阳虚型口干症燥提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄的ICR小鼠，SPF级，雌性，体质量（20±2）g，购买于上海斯莱克实验动物公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心室，许可证号：SYXK（浙）2013-0184，饲养环境：温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%。

1.2 药物与试剂 五苓散，组方：茯苓9 g，泽泻15 g，猪苓9 g，桂枝6 g，白术（炒）9 g。药材购于浙江中医药大学名医馆，分2次煎煮并合并药液，随后将药液稀释成1 g/mL，4℃保存。氢化可的松注射液（5 mL∶25 mg），天津金耀药业有限公司生产，批号H12020886。AQP-5小鼠单克隆IgG1抗体（D-7）：sc514022，购于美国Santa Cruz公司。

1.3 分组与造模 将27只ICR小鼠随机分为空白组、模型组、五苓散组，每组9只。模型组、五苓散组每天按25 mg/kg肌肉注射氢化可的松，每日1次，连续10 d，自由饮水，控制饲料量为每日100～125 g/kg体质量，连续10 d。空白组每天按0.2 mL/10 g肌肉注射生理盐水，自由饮水、饮食，每日1次，连续10 d。造模后小鼠较空白组出现体质量下降（P<0.05）、饮水减少（P<0.05）、精神倦怠、蜷曲拱背、活动减少、反应迟缓、肢尾发冷、皮毛无光泽、大便稀溏等肾阳虚表现，说明造模后期小鼠“阴损及阳”的证候改变和老年脏器衰微的气化功能衰退，提示造模成功。

1.4 给药方法 中药组按照小鼠（20 g）体表面积与成人体表面积（70 kg）比计算中药量，换算系数为0.0026，造模第11天后中药组按照每日0.2 mL/10 g灌胃药液，模型组和空白组按照每日0.2 mL/10 g灌胃蒸馏水。各组小鼠自由饮水、饮食，每日1次，连续10 d。

1.5 一般状况观察 1）观察造模后小鼠精神状态、皮毛疏松程度等现象。2）每日测体质量1次，并记录。3）每日测各组水瓶的质量，饮水量=（后一天的饮水量-前一天的饮水量）/小鼠数量。4）测定每只小鼠唾液流量，测定前禁食1 h，不禁水。在小鼠的后颊部用镊子放入5 mg的干燥无菌脱脂棉球，5 min后取出，电子分析天平上称重。唾液流量（mg）=棉球湿质量-棉球干质量。

1.6 标本采集与检测 1）颌下腺指数、病理变化。于末次给药后次日处死小鼠，分离双侧颌下腺称质量，颌下腺指数（%）=颌下腺湿质量（g）/小鼠体质量（g）×100%。颌下腺以40%的多聚甲醛固定24 h后冲洗，经酒精逐级脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切成5 μm厚的薄片，HE常规染色。100倍光镜下观察颌下腺病理改变。2）免疫组化法检测颌下腺AQP-5分布表达。采用免疫组化法，颌下腺蜡块组织切片，烘烤脱蜡及过水；切片上依次滴加抗原修复液、正常山羊血清封闭液、第一抗体（稀释浓度为1∶200）、生物素化第二抗体（IgG）、辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB显色；苏木精复染后透明、中性树脂封片。AQP-5阳性颗粒DAB显色为棕褐色及棕黄色。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示。比较采用独立样本t检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般状况及颌下腺指标比较 见表1。与空白组比，模型组饮水量和唾液流量减少，颌下腺指数明显下降，导管上皮个数明显减少，表示颌下腺出现明显萎缩，具有明显统计学差异（P<0.05）；五苓散组较模型组饮水量和唾液流率增加，颌下腺指数上升，具有统计学差异（P<0.05），导管上皮个数有所增加（P>0.05），表示颌下腺萎缩有所缓解。

表1 各组小鼠饮水量、唾液流量、颌下腺指数、导管上皮细胞个数比较（±s）

与空白组比较，∗P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组别空白组模型组五苓散组n 9 9 9饮水量（mL）5.95±0.55 5.69±0.36*5.73±0.93△唾液流量（mg）23.00±1.90 4.83±1.72*15.33±1.50△颌下腺指数（%）2.87±1.76 0.38±0.05*0.47±0.06△导管上皮个数（个/mm2）93.35±17.18 55.37±13.47*66.52±18.03

2.2 各组小鼠颌下腺组织病理学观察 见图1。空白组腺泡细胞、导管和毛细血管形态正常。模型组出现腺泡细胞萎缩、导管和毛细血管扩张，纤维组织增生等。与模型组相比，五苓散组腺泡细胞萎缩、导管和毛细血管扩张，纤维组织增生等表现减少。

图1 各组颌下腺病理切片（HE染色，100倍）

2.3 各组小鼠颌下腺免疫组化AQP-5蛋白分布表达 见图2。空白组AQP-5的表达分要分布在腺泡细胞的顶膜和基底膜中，在导管上皮中表达较少，染色显示棕黄或棕褐色颗粒；模型组染色明显减弱甚至消失；五苓散组可见中等量染色区域，较模型组染色明显。

图2 各组颌下腺AQP-5蛋白表达（DAB染色，100倍）

3 讨 论

水孔蛋白（AQPs）在调节唾液分泌的水渗透性方面起着重要作用，可以根据渗透压/静水压力梯度快速进行水的跨膜运动［2］。目前已在哺乳动物中鉴定出13个家族成员（AQP0-AQP12）。鉴于水分运动与唾液分泌息息相关，因此我们选择在唾液腺中研究AQPs的表达、定位和功能。从功能上讲，AQP-5似乎是迄今为止唯一一个在唾液分泌过程中发挥重要作用的AQP，主要分布在唾液腺的顶膜和基底膜中，与口干燥症的发病有着密切联系。AQP-5-KO小鼠是唾液腺分泌生理作用的有效模型［3］。在AQP-5-KO小鼠中，毛果芸香碱刺激的唾液减少超过60%［4］。生理上通过下颌下腺的副交感神经和腮腺中的交感激动剂控制，而且自噬和溶酶体介导的降解以及钙调蛋白都参与调控。在病理条件下，LPS在腮腺中的诱导导致NF-κB/MAPK通路被激活，导致转录因子NF-κB和AP-1（c-Fos/c-Jun）被激活，形成与NF-κB原件结合的复合物从而下调AQP-5 mRNA的转录［5］。干燥综合征（一种唾液腺功能减退，以口眼干燥为特征的自身免疫性疾病）中毒蕈碱受体自身抗体导致毛果芸香碱诱导AQP-5向颌下腺细胞顶膜的运输减少，表明AQP-5在毒蕈碱受体激动剂诱导的胞吐作用中对唾液腺顶膜运输的重要性［6］。益气养阴祛瘀方可通过调节AQP-5和毒蕈碱胆碱受体3（M3R）通道的作用，从而改善唾液腺的水分分布［7］。各种激动剂对唾液分泌的刺激作用会随着年龄的增长而降低。在M3R中起作用的乙酰胆碱对细胞顶膜中AQP-5水平的刺激作用在衰老过程中显著降低。在老化期间，M3R和Gq蛋白的量没有减少，而是降低一氧化氮合酶的活性。有研究表明，口干燥症和干燥综合征患者AQP-5 mRNA表达没有明显差异，主要定位于基底膜和腺泡细胞的顶膜中，但未定于导管细胞膜。口干燥症患者腺泡细胞顶膜AQP-5染色的强度高于对照组，干燥综合征组低于口干组。AQP-3在口干患者顶膜中几乎不表达。AQP-5和AQP-3在小唾液腺顶膜中的分布可能是区分干燥综合征和口干患者的关键因素，但易受到AQP单克隆抗体差异的影响［8］。奎宁环衍生物SNI-2011（乙酰胆碱类似物，可作用于M3R）诱导顶膜中AQP-5水平的持续增加，可能对治疗与年龄相关的口干燥症具有治疗益处［9］。也有研究表明5-Aza-CdR，一种脱甲基化剂治疗老年小鼠的AQP-5蛋白的表达水平远远高于未经治疗和幼鼠的蛋白表达水平，因此认为脱甲基化剂可能是恢复老年人唾液分泌的有效药物，有利于老年口干燥症的治疗［10］。总之，以AQP-5为靶点治疗干预与年龄相关的口干燥症被认为是有前景的策略。

在动物模型选择上，氢化可的松诱导模型是目前较为理想的肾阳虚模型。激素的应用可使机体在起初呈现烦躁多动等阴虚表现，但是激素的突然停用会导致下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴抑制状态暴露，导致机体对外界环境变化的应激、适应能力显著下降，水、电解质代谢失调，从而表现一系列的肾阳虚证候，恰符合中医所描述的“阴损及阳”的病理过程［11-12］。不仅如此，从HPA轴指标上看，氢化可的松模型也更符合肾阳虚证的要求，且对肾脏无损伤［13］。同时在选择气虚模型上，笔者也参考了李军兰等［14］通过限制ICR小鼠日摄食量的方法建造气虚证模型，以模拟老年患者脏器衰微，气化不利的表现。最后，笔者采用氢化可的松诱导联合限制日摄食量法建造出在气虚基础上的阳肾虚证模型。造模结束时笔者发现这些小鼠不但符合肾阳虚的一系列表现，而且颌下腺出现明显萎缩，且伴有饮水量、唾液流量减少的一系列口干症状，十分符合该实验的造模目的，提示造模成功。

五苓散出自《伤寒论》，是基于化气布津理论，治疗气化不利，水液内停，甚至有饮的主要方剂之一。五苓散主要用于治疗水液代谢障碍性疾病，在临床实际中水液代谢失常出现的少水、积水情况也属于五苓散证。其中就包括由于肾阳虚衰，津液输布失常所导致的口干燥症［15］。《素问·阴阳应象大论》中强调“阳化气，阴成形”，阳气不足、阴气过盛是导致津液输布失司，甚至产生水饮的基础病机。而五苓散虽多见利水渗湿药，却是以一味桂枝为主，以桂枝通阳化气，助津液调节，恢复津液吸收、输布与排泄等正常功能，不仅体现了仲景水病重气化的治疗方法［16］，也与《温病条辨》中所说的“善治水者，不治水而治气也”相一致［16］。

本研究结果发现：通过制作在气虚基础上的肾阳虚模型，小鼠唾液腺体萎缩，腺体功能衰退，AQP-5的分布表达发生变化，AQP-5在顶膜的表达更弱，而在基底膜中表达为阳性。相比较于模型组，通过五苓散干预气虚基础上的肾阳虚模型小鼠，小鼠的饮水量、唾液流量增加，颌下腺指数升高，导管上皮细胞个数增加，AQP-5在顶膜处染色更强。临床上老年患者脏器衰微，气化不利，阳虚型体质多见，阳气无以鼓动，或因干燥综合征使用激素，后期阴损及阳，所以引发的口干往往是由于津液不布，而非津液亏虚。因此，笔者从化气布津的中医理论出发，认为五苓散能够通过阳气的温煦、气化及蒸腾作用，进而调整AQP-5在颌下腺的分布表达，在一定程度上缓解口干燥症的症状［17］。然而仅使用组织切片无法区别AQP-5在腺泡和导管细胞中的运输，若能采用激光共聚焦显微镜进一步研究AQP-5的运输功能，更有探索价值。本次实验研究结果，或为中医化气布津理论提供现代化的思考，也为临床中应用五苓散治疗老年肾阳虚型口干燥症提供一定的现代医学依据。