电针干预对功能性消化不良大鼠下丘脑CRF及其受体的影响∗

金 恒 凌家艳△ 徐派的

（1.湖北省武汉市第一医院，湖北 武汉 430022；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

功能性消化不良（FD）是一种无器质性病变的胃肠疾病，其发病机制主要与胃肠运动障碍、脑肠互动异常、肠道菌群失调、内脏敏感性增高、肠道低度炎症、精神心理因素等密切相关，其中因生活工作压力等精神心理因素致病率较高［1-2］。促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）可在外周及中枢分泌，是重要的神经内分泌肽。研究发现［3］，有焦虑、抑郁行为的大鼠部分脑区CRF水平增加，当给大鼠注射外源性CRF制剂时会引起焦虑样行为。因此，CRF及其受体与精神因素相关。本实验探究CRF及其受体在FD发病中的作用，探讨FD的发病机制，为针刺治疗FD提供实验依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠36只，体质量180～220 g，购于湖北省医学科学研究院实验动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。将其饲养于湖北中医药大学实验中心SPF动物房。室温22～25℃，相对湿度50%～70%。在明暗12 h交替光照环境中适应性喂养7 d后开始实验。本实验所有操作均符合《关于善待实验动物的指导性意见》的各项规定。

1.2 试剂及仪器 1）试剂：CRF、CRF-R1、CRF-R2、β-actin抗体（美国Abcam公司）；磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；水合氯醛（上海国药集团公司）。2）仪器：HAMS-200A穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司），针灸针（规格：直径0.22 mm，长25 mm，中研太和一次性无菌针灸针），垂直电泳槽、电转仪（北京六一仪器厂），全自动酶标仪（美国赛默飞世尔公司），离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），旷场实验箱（上海欣欣），自制大鼠鼠衣及悬挂大鼠装置。

1.3 分组及造模 将36只大鼠随机分为正常组12只，造模组24只。采用改良夹尾法+0℃生理盐水灌胃+不规则饮食法同时干预建立FD大鼠模型［4-5］。具体方法如下：用尖端缠绕厚胶布的止血钳夹住大鼠尾巴末端1/3处，令大鼠尖叫、站立并与同笼大鼠互相厮打。钳夹大鼠尾部以不破皮为度。若有皮损注意随时用5%皮肤消毒剂消毒。于每日9∶00及15∶00两个时间段各夹尾1次，每次持续30 min。每次夹尾结束后用0℃ 0.9%氯化钠注射液灌胃，每只2 mL，每日2次。同时逢单日禁食，双日给予300 g饲料，自由饮水。以上干预持续2周。若大鼠出现毛发杂乱、发黄，大便稀溏、恶臭，反应迟钝，喜蜷缩等症状后，随机选取两只大鼠解剖发现无腹部异常、胃肠溃疡等器质性病变，表明造模成功。造模过程中，正常组正常饮食，同造模大鼠一样实施抓取，不进行夹尾及0℃生理盐水灌胃等操作。造模结束后，成模大鼠分为模型组11只，电针组11只。

1.4 干预方法 电针组在造模结束后第2天开始干预。将大鼠穿上自制鼠衣固定于鼠架后，参照《实验针灸学》［6］“足三里”（即大鼠“后三里”）及“太冲”穴定位。75%酒精棉球消毒后用针灸针直刺2～8 mm，分别将两侧“足三里”穴及“太冲”穴接HAMS-200 A电针仪，参数设置为连续波，频率2 Hz，电流强度1 mA，每次干预30 min，每日1次，连续干预14 d。正常组、模型组不予干预，但是在电针组干预期间行同样抓取、穿鼠衣、鼠架悬挂固定。

1.5 旷场实验 参照文献［7］的方法进行旷场试验，每只大鼠当日测定1次，观察时间为3 min。保持实验室安静、适宜室温（22～25℃）及适宜光线强度。观测指标：根据摄像机记录的视频来记录大鼠水平运动格数、中央格停留时间及垂直站立的次数。

1.6 标本采集与检测 采用Western blotting检测CRF、CRF-R1、CRF-R2的表达。处死大鼠，将下丘脑组织加入细胞蛋白裂解液提取蛋白，提取总蛋白之后用酶标仪测定蛋白浓度。配置8%的SDS-PAGE凝胶，加样后恒压电泳跑胶，随后恒流转膜。加入5%的脱脂奶粉封闭过夜，分别加CRF、CRF、CRF-R1、CRFR2抗体后孵育2 h。清洗3次后加二抗，再次孵育2 h，显色，暗室曝光，用Quantity One软件分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，组间均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠旷场实验结果比较 见表1。与正常组比较，模型组大鼠水平运动格数、垂直运动次数及中央格停留时间均显著减少（P<0.01）。与模型组相比较，电针组大鼠水平运动格数、垂直运动次数及中央格停留时间显著增加（P<0.01）。提示模型组大鼠焦虑抑郁状态严重，经电针干预后大鼠焦虑抑郁情况明显减轻。

表1 各组大鼠旷场实验结果比较（±s）

表1 各组大鼠旷场实验结果比较（±s）

与正常组比较，∗P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。下同

组 别n 水平运动（格）垂直运动（次）中央格停留时间（s）正常组模型组电针组12 11 11 104.23±2.19 72.93±5.16*98.34±7.15△10.24±1.34 4.65±2.26*9.09±1.23△7.56±1.67 2.12±1.03*5.87±2.18△

2.2 各组大鼠下丘脑CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表达比较 见表2，图1。与正常组比较，各组大鼠下丘脑CRF、CRF-R1表达增多，CRF-R2表达减少。电针干预后，与模型组比较，CRF、CRF-R1表达减少，CRF-R2表达增多。因此电针可下调下丘脑CRF，CRF-R1的表达，上调下丘脑CRF-R2的表达。

3 讨论

随着生活及工作压力增加，人们都存在不同程度的情绪障碍，严重影响生活质量，增加社会医疗负担。已有实验证明，心理疾病及精神障碍等因素是FD的关键发病机制之一［8］。根据FD的症状，中医学将其归于“胃脘痛”“痞满”范畴，本病病位在胃，涉及肝脾。多为肝气郁滞，疏泄失职，横逆乘脾犯胃，脾胃升降失常，久则肝脾耗伤，脾失健运，运化无力。据调查发现，肝郁脾虚证是FD主要病机［9］，因此，本研究采用复合因素干预造模，对大鼠胃肠形成慢性刺激，耗损脾胃之气，久之脾胃之气虚弱。另外夹尾法使大鼠暴怒后，郁怒伤肝，综合辨证则为肝郁脾虚型FD。根据大鼠从易怒、反应快速至逐渐出现毛色枯黄、大便稀溏、喜蜷卧等症状，加之无器质性病变作为模型评价标准。

表2 各组大鼠下丘脑CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相对表达含量比较（±s）

表2 各组大鼠下丘脑CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相对表达含量比较（±s）

组别正常组模型组电针组n 12 11 11 CRF/GAPDH 0.43±0.05 0.91±0.02*0.51±0.05△CRF-R1/GAPDH 0.45±0.04 1.01±0.02*0.63±0.02△CRF-R2/GAPDH 1.11±0.01 0.46±0.35*0.69±0.03△

图1 各组大鼠下丘脑CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表达

现阶段，因西药副作用大、疗效不确定、个体差异性大等因素导致FD西药疗法具有较大局限性。而中医疗法独具特色，副作用小，因此逐渐被广大医师及患者接受。电针疗法属于中医疗法。研究表明［10-12］，电针治疗FD疗效确切。因肝郁脾虚证为FD发病的主要病机，因此采用疏肝健脾为基本治则。本研究选取的足阳明胃经合穴足三里可健脾益气，增强脾胃运化，降逆理气，是治疗胃肠道疾病的要穴，同时足三里为强壮穴，可滋后天生化之源以养先天。选取足厥阴肝经原穴太冲可疏郁结之肝气，调畅气机。二者配合以达健脾疏肝，通畅胃腑之功。

CRF家族中有CRF配体（CRF、Ucn1、Ucn2等）及CRF受体（CRF-R1、CRF-R2），其通过配体受体结合发挥多种效应。CRF是由41个氨基酸组成的重要神经内分泌肽，主要分布于中枢神经系统（如下丘脑）及外周组织（如胃肠道），在下丘脑室旁核表达较高［13］。CRF调控多种神经、内分泌、免疫等反应，通过激活促肾上腺皮质激素释放因子受体（CRFR），在神经系统、消化系统、皮肤系统、内分泌系统等方面均发挥重大作用，能调控神经内分泌、炎性反应、行为及精神改变等［14］，是机体重要的神经递质。CRF发挥其生理作用主要是通过与其受体结合而实现的，CRF受体中CRF-R1、CRF-R2具有生物学活性，参与CRF的大部分生物效应［15］。脑内CRF主要与CRF-R1结合产生效应，CRF-R1在哺乳动物中枢神经系统中广泛分布，通过调控丘脑-垂体-肾上腺轴而调节促肾上腺皮质激素、糖皮质激素的分泌［14］，CRF-R2主要在外周分布，参与调控机体能量平衡［16］。研究表明，CRF-R1具有促进焦虑、抑郁发生作用，而CRF-R2具有抗焦虑抑郁作用［17］。

本研究进行旷场实验，从行为学角度评价各组大鼠焦虑抑郁情况；另外采用Western blotting检测大鼠下丘脑CRF、CRF-R1、CRF-R2表达，从蛋白水平评价电针干预下FD大鼠的发病机制。本研究结果发现，与模型组比较，电针干预后大鼠水平运动格数、垂直运动次数、中央格停留时间显著增加，提示电针干预可减轻大鼠焦虑抑郁状态。大鼠下丘脑CRF、CRF-R1表达降低而CRF-R2表达升高，提示电针干预可调节CRF及其受体的平衡。因此，根据本实验结果所示，电针可能是通过下调下丘脑CRF、CRF-R1，上调CRF-R2来减轻大鼠焦虑样行为治疗FD，且CRF-R1、CRF-R2之间的平衡与FD发病相关，从心理及精神因素角度揭示FD发病机制及电针疗法对FD的作用机制。本课题组下一步会阻断CRF受体，开展观察大鼠焦虑样行为是否变化等一系列实验来进一步探究电针治疗FD的机制。