参桂汤对大鼠急性心肌缺血的保护作用∗

王凤儒 徐京育 杜 琳 成春锋 梁 群△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

心肌缺血是由于冠脉循环与心肌供需失衡而引起的一类临床常见疾病，其发病机制复杂，病死率高，严重影响人们的生活质量［1-3］。近年来随着中医药对心肌缺血保护作用的研究逐渐深入，临床上治疗心肌缺血的中成药复方制剂日益增多［4-7］。中医药治疗冠心病心绞痛临床效果显著且耐药性较少，优势明显［8-9］。参桂汤由丹参、苦参、玄参、桂枝4味中药组成，是本科治疗冠心病心肌缺血及心律失常的常用方剂。本实验予垂体后叶素诱导大鼠出现急性心肌缺血状态，观察各组大鼠心肌缺血及心律失常程度，明确参桂汤抗心肌缺血的机制及作用靶点，为新药的研发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，体质量220～250 g，雌雄各半，SPF级，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。

1.2 试药与仪器 参桂汤，药物组成：苦参30 g，丹参20 g，玄参20 g，桂枝15 g；由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科按原生药质量浓度1.530 g/mL规格煎制。0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号0B72H2），垂体后叶素（宁波第二激素厂，批号150624），盐酸胺碘酮（赛诺菲杭州制药有限公司，批号8HG0313），3%戊巴比妥钠；乳酸脱氢酶测定试剂盒（富士胶片和光纯药株式会社，批号AH991），超氧化物歧化酶（SOD）活性试剂盒（北京诚林生物科技有限公司，批号201811），丙二醛（MDA）试剂盒（北京诚林生物科技有限公司，批号201811），一氧化氮合成酶（iNOS）试剂盒（北京诚林生物科技有限公司，批号201811）。ECG-1150型心电机，AB204-N电子秤。低温高速离心机（日本日立公司），稳压电源（天能，EPS300），超低温冰箱（中科美菱，DW-HL328），多功能微孔板检测仪（Infinite M1000 Pro，Tecan，瑞士），Milli-Q纯水仪（Milli-Q Gradient，Millipore，美国），托盘天平（天津医疗器械厂），常规手术器械若干（京津医疗器械厂）。

1.3 分组与给药 将56只大鼠随机分为7组：空白组，假手术组（予等体积0.9%氯化钠溶液）及模型组（予等体积0.9%氯化钠溶液），胺碘酮（25 mg/kg）组，参桂汤高（3.060 g/200 g）、中（1.530 g/200 g）、低（0.765 g/200 g）剂量组，每组8只，连续灌胃给药14 d。

1.4 模型制备 末次给药1 h后，称取大鼠体质量，3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行腹腔注射麻醉，固定并连接心电图机，测定心电图至正常（麻醉后测定心电图S点不高于基线为合格）。于5～10 s内完成各组大鼠舌下静脉注射垂体后叶素（0.5 U/kg，1 U/mL），空白组及假手术组除外。

1.5 标本采集与检测 观察并记录注射垂体后叶素后各组大鼠5、15、30、60、300 s的ECG，20 min后处死大鼠，于腹主动脉处采血5 mL，放置于4℃冰箱1 h，3 000 r/min冷冻离心10 min，取血清2 mL放入EP管内，-80℃冰箱保存。测定时快速解冻，ELISA法测定血清iNOS、MDA含量和SOD的活性，按照试剂盒说明书测定，酶标仪测定吸光度A值（波长为450 nm）。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示。进行组间方差分析及t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间段心电图ST段表现比较 见表1。在注射垂体后叶素之前各组之间无明显差异，注射垂体后叶素后，模型组在5 s时ST段显著抬高，抬高幅度超过0.1 mV，与空白组比较具有显著差异（P<0.01），提示造模成功。模型组给药后15 s内ST段持续升高，30 s时出现回落，60 s回落明显，300 s时ST段接近于正常。各给药组在注射垂体后叶素后均能够对抗ST段的升高，升高幅度均不超过0.1 mV，与模型组比较均有统计学差异（P<0.05）。各给药组ST段在15 s时已出现明显回落，时间较模型组提前，与模型组比较均有统计学差异（P<0.05）。造模后60 s，与模型组比较，各药物组ST段均显著性降低，效应强度为：胺碘酮组>参桂汤高剂量组>参桂汤中剂量组>参桂汤低剂量组。

表1 各组大鼠不同时间段心电图ST段表现比较（mV，±s）

表1 各组大鼠不同时间段心电图ST段表现比较（mV，±s）

与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下同

注射垂体后叶素后组 别n 注射垂体后叶素前5 s 15 s 30 s 60 s 300 s空白组假手术组模型组胺碘酮组参桂汤低剂量组参桂汤中剂量组参桂汤高剂量组8 8 8 8 8 8 8 0.03±0.02 0.02±0.02 0.02±0.03 0.02±0.02 0.02±0.02 0.02±0.01 0.03±0.01 0.05±0.02△△0.03±0.01△△0.22±0.15 0.06±0.05△△0.09±0.03△0.07±0.06△0.05±0.07△△0.04±0.01△△0.02±0.02△△0.25±0.11 0.03±0.03△△0.04±0.02△△0.04±0.03△△0.02±0.03△△0.04±0.03△0.02±0.02△0.21±0.12 0.02±0.01△△0.04±0.02△0.03±0.01△△0.02±0.01△△0.04±0.02△△0.03±0.02△△0.14±0.09 0.02±0.03△△0.03±0.01△△0.01±0.02△△0.02±0.00△△0.04±0.01△△0.03±0.03△△0.06±0.03 0.01±0.00△△0.02±0.00△△0.01±0.00△△0.01±0.00△△

2.2 各组血清iNOS、MDA、SOD水平比较 见表2。空白组与假手术组之间无统计学差异，模型组大鼠血清中iNOS、MDA的活性水平明显高于空白组，SOD活性水平显著低于空白组（P<0.05），提示造模成功。各给药组与模型组比较血清SOD活性水平不同程度提高，血清MDA、iNOS活性水平不同程度降低，差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。在降低iNOS和MDA方面，参桂汤高、中剂量组与胺碘酮组无统计学差异（P>0.05），参桂汤低剂量组降低大鼠血清中MDA的水平不如胺碘酮组有效（P<0.01）。

表2 各组血清iNOS、MDA、SOD水平比较（±s）

表2 各组血清iNOS、MDA、SOD水平比较（±s）

组别空白组假手术组模型组胺碘酮组参桂汤低剂量组参桂汤中剂量组参桂汤高剂量组n 8 8 8 8 8 8 8 iNOS（μmol/L）0.59±0.015 0.62±0.017 1.71±0.105**1.19±0.128△△1.39±0.038△△1.15±0.069△△0.95±0.080△△MDA（nmol/L）0.79±0.418 0.91±0.180 1.68±0.131*1.22±0.059△1.40±0.019△1.23±0.108△△1.09±0.076△△SOD（ng/L）45.67±5.894 44.85±8.678 14.28±4.740**32.40±1.264△△18.95±0.263△28.88±0.620△△31.30±0.876△△

3 讨 论

1938年Milville用垂体后叶素成功建立急性心肌缺血动物模型，此后学者对该模型分别从心电图、冠脉流量、血流动力学等方面进行缺血效应的观察，均取得了良好的效果，因此常被用于模拟临床变异性心绞痛的发病过程。该模型操作简单易行，成功率高，可以用不同剂量的垂体后叶素造成不同程度的心肌缺血损伤，后来也成为众多学者研发抗心肌缺血药物的经典模型。垂体后叶素中含有血管升压素，大剂量的垂体后叶素能够使全身血管平滑肌收缩，该作用更多的突出表现在收缩毛细血管和小动脉，造成外周阻力增加，血压升高，加重心脏负荷，同时也可引起冠脉血管痉挛，造成心肌急性缺血缺氧［10］。我们采用此模型来观察参桂汤对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血的保护作用。

心电图ST段的变化反映了心肌缺血性损伤的范围及程度，本实验结果表明参桂汤高、中、低剂量均能够明显抑制垂体后叶素引起的大鼠心电图ST段的变化，降低大鼠心肌缺血的程度和阳性率，说明参桂汤具有抗心肌缺血作用。

当心肌急性缺血缺氧时，无氧糖酵解就会成为ATP的主要来源［11］，氧自由基的生成就会增加，造成广泛的氧化损伤，并可激发炎症反应［12］。同时氧自由基的增加也会加重脂质过氧化，SOD是氧自由基的主要代谢酶，主要作用是清除氧自由基，减轻氧自由基对心肌细胞的损伤［13］。研究发现，心肌缺血时会产生大量的氧自由基，SOD的活性水平会明显下降，SOD可以用于评估脂质过氧化反应的程度［14］。MDA是氧自由基脂质过氧化的最终产物，其活性水平能够反映脂质过氧化的程度以及细胞损伤程度［15］。iNOS在正常生理情况下含量极低，当发生心肌缺血缺氧时，多种炎性因子表达增多，促使巨噬细胞分泌大量的iNOS，同时iN⁃OS的活化也会增加炎性因子的分泌，二者恶性循环，加重心肌细胞的损伤［16］。因此MDA、SOD和iNOS能够间接反映心肌损伤程度。

本实验结果表明参桂汤高、中、低剂量均能改善因垂体后叶素引起的大鼠急性心肌缺血，参桂汤高、中剂量组能够显著降低急性心肌缺血大鼠血清中MDA水平，降低iNOS的含量，提高内源性抗氧化性酶SOD的含量，从而表明参桂汤可能通过抗氧自由基损伤，减轻脂质过氧化反应等达到改善心肌缺血缺氧的作用。

心肌缺血在中医可归于“胸痹”“心悸”范畴。病理基础为心之气血两虚日久，血瘀、湿浊等邪毒痹阻于心而致心脉不通，瘀久化热。治疗上以补虚为本，兼以清热、活血、化湿。补虚者，补心之阴阳，心阳足则温煦心之血脉，使血脉流通，是心阴充沛的前提条件，心阴充则心血滋养脏腑，使五脏得养，是心阳充足的物质基础。参桂汤中苦参为君药，具有苦寒入心，清热燥湿的作用，正如《本草经百种录》所言“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦参专治心经之火”。丹参、玄参共为臣药。丹参苦，微寒，归心、心包、肝经，中医古语云：一味丹参饮，功同四物汤；《本草纲目》记载其有活血，通心包络的功效；《医林改错》中强调治疗心悸时若百方无效，则可换用活血化瘀之法，可见奇功。丹参一味既补血又活血，实乃心经要药。玄参苦、微寒，入肾经，滋养肾阴。心肾两脏以少阴经相连，肾阴充则可消心火又不伤心阳。以桂枝为佐药，桂枝一味其味辛、甘、温，其温阳之效甚佳，又不似附子之燥热，又入心、肺、膀胱经，《别录》云“桂通血脉”，《素问》曰“心主身之血脉”，故而桂枝乃温心阳、通血脉之佳品，丹参养心阴，桂枝补心阳，两者合用，效果甚佳。参桂汤药味少，疗效高，具有补虚、清热、活血、燥湿的作用。综上所述，参桂汤通过提高SOD活性水平，降低氧自由基含量，减轻脂质过氧化，从而起到保护缺血心肌的作用。