络风宁1号方对心梗大鼠血管内皮功能的治疗作用∗

孙 天 王 显

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

本文通信作者王显教授及其团队认为急性心血管事件的临床特点与风证动摇不定的特点相类似，表现为发病迅速、病情变化多端，病位在心络，创新提出动脉粥样硬化络风内动学说［1-2］，并已经得到邓铁涛教授、王永炎院士、陈可冀院士及一批专家的认可并共同发表了胸痹心痛络风内动证诊断专家共识［3］。根据络风内动学说研发的络风宁1号方由徐长卿、地龙、三七、冰片组成，具有祛风通络、活血化瘀作用［4-5］。本实验旨在研究络风宁1号方对心梗大鼠血管内皮的保护作用，为其防治心血管疾病机制提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量（250±10）g，由北京维通利华实验动物中心提供，实验动物许可证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物与试剂 络风宁1号方，组成：徐长卿、地龙、三七、冰片组成（剂量保密，处方专利申请中），由北京中医药大学东直门医院药房提供；卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号1306032）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号F3056114）；戊巴比妥钠（上海新亚药业有限公司，批号H31021742）；内皮素（ET）放免试剂盒、一氧化氮（NO）放免试剂盒、前列环素（PGI2）放免试剂盒、血栓素A2（TXA2）放免试剂盒均购自北京华英生物技术研究所；血栓调节蛋白（TM）酶联免疫试剂盒（批号162321）、内皮细胞蛋白C受体（EPCR）酶联免疫试剂盒（批号162013）均购自北京尚柏生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 JA1003N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；ALC-V8型呼吸机，上海奥尔科特生物科技有限公司；3K15型离心机，北京博劢行仪器有限公司；BCD 185B型冷冻箱，长岭（集团）股份有限公司；r-911全自动方免计数仪，中国科技大学实业总公司。752-P型紫外分光光度计，上海现科分光仪器有限公司；MultiSkan FC酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。BX60型光学显微镜，日本奥林巴斯公司；SPOT-Ⅱ数码成像系统，Diagnostic Instruments公司；MetaMorph图像分析系统，Vniversal Imaging公司。

1.4 造模与分组 SD大鼠称重并按随机数字表法均分为假手术组、模型组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组。采用大鼠左冠状动脉前降支结扎的方法制备心肌梗死模型。用1%的戊巴比妥钠腹腔注射（0.5 mL/100 g）全身麻醉后，背部固定在手术板上，行经喉气管插管术，连接呼吸机，以80次/min，吸呼比1∶2，潮气量0.7～0.8 mL辅助呼吸。在左侧第3、4肋间切开皮肤，逐层钝性分离肌层，撕裂心包膜使心脏充分暴露，进针位置在主动脉根部约3 mm处，用5/0带线缝合针结扎左冠前降支，当心电图Ⅰ导联显示ST段显著抬高后，肉眼观察结扎部位以下心肌变灰白，搏动减弱，彻底止血后逐层缝合关闭胸腔。假手术组手术过程相同，仅穿线不结扎。术后肌肉注射青霉素连续3 d。手术全部过程严格无菌操作。造模中假手术组和络风宁1号组各死亡1只大鼠。

1.5 给药方法 成模后当日络风宁1号组及联合用药组予含生药量4.81 g/（kg·d）的络风宁1号方汤剂，卡托普利组及联合用药组予卡托普利药液7.5 mg/（kg·d），假手术组及模型组予相同体积蒸馏水。各组均每天灌胃2次，连续给药4周。

1.6 标本采集与检测 1）血管内皮活性物质检测。硝酸还原酶法检测血浆NO，ELISA法检测血浆PGI2、ET、TXA2含量、血清sEPCR、sTM含量。2）心梗面积测定。取大鼠心脏用4℃预冷生理盐水洗去血污，剪去心房、右心室（保留室间隔）及血管、脂肪组织，取左心室-20℃速冻后切片，沿心尖向基底部以2 mm为标准连续切片，放入1%TTC磷酸缓冲液中，置于恒温37℃水浴箱染色15 min。染色后梗死区心肌呈灰白色，未梗死区呈砖红色。将梗死心肌与未梗死心肌剥离分别称质量，以梗死心肌占左室心肌质量百分比表示梗死范围。3）心肌组织取材时选择在左室最大横径处横切，并用4%的多聚甲醛固定备用，制作石蜡切片，用于常规组织学染色。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模后3 d，心梗大鼠饮食、活动均减少。实验过程中，模型组大鼠精神萎靡，活动减少，毛竖欠光泽，舌头呈绛紫色。其余各用药干预组大鼠精神萎靡渐好转，毛竖略带光泽，舌头转为紫色。

2.2 各组大鼠血浆NO、PGI2、ET、TXA2含量比较 见表1。模型组血浆NO、PGI2含量明显低于假手术组（P<0.01），络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组大鼠血浆NO、PGI2高于模型组（P<0.05或P<0.01），络风宁1号组与联合用药组NO、PGI2与卡托普利组比较无明显差异（P>0.05）。模型组血浆ET、TXA2含量明显高于假手术组（P<0.01），络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组大鼠血浆ET、TXA2低于模型组（P<0.05或P<0.01）；络风宁1号组与联合用药组ET、TXA2与卡托普利组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 各组大鼠血清中sEPCR、sTM含量比较 见表2。与假手术组相比，模型组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组血清sEPCR、sTM含量增高（P<0.01）；与模型组比较，假手术组、络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组血清sEPCR、sTM含量均降低（P<0.05或P<0.01）；与卡托普利组比较，假手术组、联合用药组血清sEPCR、sTM含量降低，模型组、络风宁1号组血清sEP⁃CR、sTM含量升高，其中假手术组、模型组、络风宁1号组差异有统计学意义（P<0.01）。

表1 各组大鼠血浆NO、PGI2、ET、TXA2含量比较（±s）

表1 各组大鼠血浆NO、PGI2、ET、TXA2含量比较（±s）

与假手术组比较，∗P<0.01，∗∗P<0.05；与模型组比较，#P<0.01，##P<0.05；与卡托普利组比较，△P<0.01，△△P<0.05。下同

组别假手术组模型组络风宁组联合用药组卡托普利组n 7 8 7 8 8 NO（μmol/L）119.69±15.50#△72.98±9.12*△△85.93±13.29*101.94±20.29**#91.85±10.86*##PGI2（pg/mL）213.53±11.15#△154.59±24.81*△167.99±26.11*197.54±18.25#184.26±16.34*#ET（pg/mL）58.40±18.83#92.87±11.74*△△73.95±14.40##71.99±15.42##74.04±17.98##TXA2（pg/mL）122.76±27.18#161.26±7.58*△127.69±25.72#127.06±35.79#125.98±22.00#

表2 各组大鼠血清sEPCR、sTM含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠血清sEPCR、sTM含量比较（pg/mL，±s）

组别假手术组模型组络风宁1号组联合用药组卡托普利组n 7 8 7 8 8 sEPCR 214.68±42.58#△437.25±24.59*△387.99±10.66*#△318.87±35.53*#325.03±29.68*#sTM 62.69±6.98#△95.80±3.44*△89.49±4.34*##△77.88±4.73*#79.67±5.22*#

2.4 各组大鼠心梗情况比较 见表3。与假手术组比较，模型组梗死范围大（P<0.01）；与模型组比较，络风宁1号组、联合用药组、卡托普利组能降低心肌梗死范围（P<0.05或P<0.01）；与卡托普利组比较，络风宁1号组、联合用药组梗死范围加大，但差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠心梗情况比较（±s）

表3 各组大鼠心梗情况比较（±s）

组别假手术组模型组络风宁1号组联合用药组卡托普利组n 7 8 7 8 8左室质量（mg）509.12±9.21 765.00±5.25 698.53±10.87 656.08±5.14 679.30±2.41梗死心肌质量（mg）0 132.21±7.78 103.42±8.62 77.79±6.96 83.56±8.06梗死范围（%）0 19.44±4.78*△13.85±5.78##9.78±3.86#11.58±3.03#

2.5 各组心梗大鼠心肌组织病理观察 见图1。HE染色显示，假手术组心肌结构正常，心肌纤维排列整齐，无肿胀坏死萎缩。模型组发生大面积局灶性病变，变性坏死明显，心肌纤维排列紊乱、断裂，心肌细胞疏松、肿胀，存活心肌组织被分隔成岛状或细带状。络风宁1号组：心肌梗死区及梗死边缘区病理改变与模型组相似，但心肌梗死区病变范围较模型组减小，较卡托普利组病变范围增大。联合中药组：心肌梗死区及梗死边缘区病理改变与模型组相似，但心肌梗死区病变范围较模型组显著减小，较卡托普利组病变范围减小。卡托普利组：心肌梗死区及梗死边缘区病理改变与模型组相似，但心肌梗死区病变范围较模型组、络风宁1号组减小。

图1 各组心梗大鼠心肌组织病理观察（HE染色，400倍）

3 讨论

血管内皮作为循环血液与血管平滑肌之间的中介组织，可以合成和分泌许多血管活性物质作用于血管平滑肌，从而影响血管的收缩与舒张功能。NO为主要的舒张松弛因子，ET为主要的缩血管因子，这两类活性物质在调节血管收缩、舒张功能方面具有相互拮抗作用，以维持血管及血液内环境的平衡。心梗患者和心梗大鼠模型中均存在NO合成减少和ET增多［6-8］。内皮细胞释放的PGI2主要作用是抑制血小板聚集，并且拮抗TXA2使血管扩张，TXA2由血小板产生，具有血小板凝聚及血管收缩作用。大量临床及实验证实心梗患者内皮细胞合成和释放的PGI2减少，而TXA2增加［9-11］，从而使血管结构改变，促进血栓形成，造成血管内皮损伤。正常状态下，血管内皮细胞通过其抗凝作用维持血液正常流动，其主要与蛋白C系统和凝血酶Ⅲ-硫酸乙酰肝素密切相关，其中EPCR、TM是蛋白C系统中的两个关键蛋白［12-14］。当血管内皮细胞受到损伤时EPCR、TM被释放入血循环，使得血浆中sEPCR、sTM升高，故血浆sEPCR、sTM水平的过度增高可反映血管内皮细胞的损伤状态，并提示体内内源性凝血酶生成增多，故sEPCR、sTM可作为高凝状态的标志之一［15］。

中医学没有“心肌梗死”的病名，根据其临床表现，属于中医“胸痹”“中风”等范畴。中医认为心肌梗死病位在血脉，根本在脏腑，病性属于本虚标实。临床研究证实，胸痹心痛多为反复性、阵发性。从冠心病疼痛部位和性质看，许多患者除了典型的心前区疼痛外，还累及下颌部、咽颈、肩臂等多个部位，患者的疼痛性质也分为刺痛、绞痛、闷痛等多种形式，这种发病特点与中医学风邪类似。患者心电图表现特点也呈现诸如ST段及T波动态改变、新发房室阻滞、突发室性心动过速、室颤等，其多变的形式类似于中医的风证，这就说明中医风证与胸痹心痛存在着内在联系［16-18］。通信作者王显教授及其团队在临床实践中针对胸痹病首次提出络风内动学说，强调治疗当以祛风通络、活血化瘀为主。课题组根据《太平圣惠方》提到的治疗邪毒疠气传入心包所致的心痛，症见憋闷欲死，可以用鬼督邮、安息香治疗。本研究选择具有祛风通络、活血化瘀作用的鬼督邮（徐长卿）、地龙、三七、冰片4味中药组成络风宁1号方。络风宁1号方中徐长卿祛风止痛，地龙清热通络共为君药，共奏祛风通络之功，三七散瘀止痛为臣药，冰片清热止痛，调和诸药。诸药相合以祛风通络为主，整体调节脏腑功能，做到标本兼顾［19］。本实验采用心梗大鼠模型，于药物干预4周后观察血浆NO、PGI2、ET、TXA2、sEPCR、sTM含量变化，结果显示络风宁1号方可以增加NO、PGI2含量，降低ET、TXA2、sEPCR、sTM含量，说明络风宁1号方可能通过增加NO、PGI2含量，降低ET、TXA2、sEPCR、sTM含量减轻心血管内皮损伤，降低心肌梗死面积，改善心肌组织病理变化，进而减轻心梗大鼠心肌损伤，这对治疗心肌梗死大有裨益。络风宁1号方更多的有效机制有待进一步研究。