双斑东方鲀鱼皮胶原多肽的制备及其在化妆品中的功效与刺激性评价
2020-07-29蔡水淋廖登远刘智禹
陈 贝，张 鸽，乔 琨，许 旻，蔡水淋，廖登远，刘智禹*
1福建省水产研究所 国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门)福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，厦门 361013；2集美大学食品与生物工程学院，厦门 361021
河豚鱼肉味鲜美，营养丰富，尤其在亚洲国家被视为美味。双斑东方鲀是福建省养殖河豚的主要品种之一。养殖双斑东方鲀品质优良、毒性较低，其中鱼皮与鱼肉均为无毒级别，可安全食用。目前双斑东方鲀的加工尚处于起步摸索阶段，加工制品种类少且加工深度不足。鱼皮作为双斑东方鲀的无毒部分，其深度加工利用和高附加值产品的研发，对于充分利用河豚鱼资源，提高加工技术含量，调整河豚鱼产业结构都具有重要的意义。
水解胶原多肽能为人体胶原蛋白的合成提供优质的氨基酸原料，促进皮肤胶原蛋白合成，提高皮肤保水能力，减少皱纹形成，延缓皮肤衰老，是一种优质的化妆品添加剂。河豚鱼皮中蛋白质含量占干重的80%以上，其中胶原蛋白占总蛋白质的90%左右，是一种优质的胶原蛋白及胶原多肽原料。本研究以双斑东方鲀鱼皮为实验对象，利用碱性蛋白酶酶解获得双斑东方鲀鱼皮胶原多肽(Fugubimaculatuscollagen peptide，FBCP)，明确最佳酶解工艺，分析不同分子量FBCP的保湿和抗氧化性能，并对FBCP皮肤刺激性和眼刺激性进行评估，为FBCP在化妆品中的应用提供理论基础。
1 材料与仪器
1.1 实验试剂
碱性蛋白酶(B8360)购于北京索莱宝科技有限公司；猪胶原多肽粉(ARTHREDTMP Standardized)和牛胶原多肽粉(ARTHREDTMStandardized)购于嘉吉生化有限公司；邻苯三酚、水杨酸、H2O2及其他常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 实验动物
双斑东方鲀(Fugubimaculatus)，购于漳州市漳浦县福建鸿鲀水产养殖有限公司，生产许可证号：闽(浦渔2018)海渔苗种许字01号；成年新西兰白兔，体重2.0～2.5 kg，实验动物采购及刺激性评价均委托国家化妆品质量监督检验中心进行。
1.3 仪器
绞肉机(MM12，广东韶关市食品机械厂)，真空冷冻干燥机(SCIENTZ-10N，宁波新芝生物科技股份有限公司)，酶标仪(M200 Pro，Tecan)，凯氏定氮仪(KjeltecTM400，FOSS)，pH计(MID5X，METTLER TOLEDO)，数显恒温水浴锅(SCIENTZ-10N，宁波新芝生物科技股份有限公司)，分析天平(BSA224S，SRTORIUS)，多探头皮肤测试系统(MPA4，CK公司)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司)。
2 实验方法
2.1 双斑东方鲀鱼皮基本组分分析
分别按照GB5009.5-2010、IS03496：1994(E)、GB/T5009.3-2010、GB5009.6-2003和GB5009.4-2010，测定样品的粗蛋白含量、羟脯氨酸含量、水分含量、脂肪含量和灰分含量。
2.2 FBCP提取工艺
双斑东方鲀经皮肉分离后，去除鱼鳍，之后将干净的鱼皮切成(约0.5×0.5 cm2)碎片，冷冻干燥，备用。冻干处理后的鱼皮浸泡浓度为9% NaCl溶液(1∶30)[1]，连续搅拌24 h，每12 h换一次NaCl溶液，浸泡后用蒸馏水水洗鱼并用尼龙纱过滤，重复3次，除去非胶原蛋白。
鱼皮经过预处理后，按一定的料液比加入纯水，调节pH和酶解温度，加入碱性蛋白酶进行酶解。酶解完成后，100 ℃将酶灭活10 min，待酶解液冷却至室温，调节酶解液的pH至中性，离心取上清，经超滤膜分离得到4种不同分子量的双斑东方鲀鱼皮胶原多肽组分。冷冻干燥获得胶原多肽粉末。
2.3 FBCP提取单因素实验
以肽得率为指标，研究酶用量、温度、时间、pH四个因素对双斑东方鲀鱼皮酶解效果的影响，以确定各因素的最佳酶解条件。酶解的基本条件为加酶量4 000 U/g，温度50 ℃，时间4 h，pH 9.0，料液比1∶10。选择固料比1∶10为固定参数，改变其他任意一个条件，分别考察酶添加量(4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、酶解温度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解时间(1、2、3、4、5 h)和pH(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)对酶解效果的影响。
2.4 FBCP提取正交试验
本研究根据以上的单因素实验分析结果，选择固料比1∶10为固定参数，以肽得率为指标，设计酶解温度、酶解时间、酶解pH值、加酶量的四因素三水平正交实验L9(34)(表1)。
表1 正交因素水平
2.5 肽得率的测定
采用三氯乙酸(TCA)沉淀法结合甲醛滴定法测得肽得率[2]。主要原理是利用TCA沉淀酶解液中的大分子蛋白质，继而以凯氏定氮法测定上清液中可溶性氮的含量，随后减去上清中氨态氮(游离氨基酸)的含量，再与酶解样品中的总氮量相比，从而确定其多肽得率。计算公如下：
蛋白肽得率=
具体方法为取酶灭活后的胶原多肽提取液10 mL，加入等量30% TCA溶液，充分混匀，静置10 min，4 000 rpm离心10 min。取2 mL离心后的上清液，凯氏定氮测其蛋白质含量，再取2 mL上清液定容至10 mL，以酚酞作指示剂取5 mL稀释液加入中性甲醛溶液2 mL混匀，于0.05 mol/L的标准氢氧化钠滴定至紫红色(pH值8.7～9.0)。记录消耗氢氧化钠体积。氨态氮含量计算公式如下：
其中，V1：待测液消耗氢氧化钠体积，单位为毫升(mL)；V2：滴定空白对照消耗氢氧化钠体积，单位为毫升(mL)；c：标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度；0.014：与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[(NAOH)=1.00 mol/L]相当于氮的质量(g)；m：称取式样的质量(g)；V3：式样稀释液的取用量(mL)；V4：式样稀释液的定容体积(mL)。
2.6 FBCP化妆品功效性研究
依次通过截留分子量为10、5、1 kDa的超滤膜，分离得到四种不同分子量的河鲀鱼胶原多肽组分FBCP1(Mw<1 kDa)、FBCP2(1 kDa
2.6.1 吸湿保湿功效研究
将不同胶原多肽粉末置于105 ℃的烘箱中充分干燥至衡重。选用两个相同大小的干燥器，分别在底部加入饱和硫酸铵和饱和碳酸钾溶液，使之分别维持70%的相对湿度(RH)及40%的相对湿度(RH)，其中RH=70%模拟夏天空调房最佳湿度，RH=40%模拟冬天空调房最佳湿度。胶原多肽各取1 g分别置于两个干燥器内，在保持环境温度为25 ℃左右的条件下放置2、4、6、8、10 h，取出后精确称量并计算得出吸湿率[1,3]。计算公式为：
其中：W0：放置前样品质量(g)；Wn：放置后样品质量(g)。
胶原多肽各取1 g分别加入2 mL蒸馏水充分溶解后置于干燥器内，放置2、4、6、8、10 h，称量并计算出保湿率[1,3]。计算公式为：
其中：H0：放置前样品质量(g)；Hn：放置后样品质量(g)。
2.6.2 抗氧化功效研究
其中：A0：邻苯三酚的自氧化速率；A1：第1 min的OD值；A4：第4 min的OD值。
胶原多肽抑制邻苯三酚自氧化速率的测定：分别依次加入50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.7 mL以及不同浓度的胶原多肽溶液4 mL，于25 ℃水浴锅中保温10 min，取出后加入0.3 mL已预热的邻苯三酚立即混匀并同上测定OD值并计算自氧化速率ΔA。胶原多肽对超氧离子的清除率计算公式如下：
其中：ΔA0：邻苯三酚的自氧化速率；ΔA：加入待胶原多肽后邻苯三酚的自氧化速率。
2.6.2.2 羟基自由基(·OH)清除能力测定
测定方法参考Zhang和Ding等方法[4-6]，具体如下，取10 mL试管依次加入FeSO4(9 mmol/L)l mL、水杨酸-乙醇(9 mmol/L)l mL、不同浓度胶原多肽溶液l mL，混匀后加入8.8 mmol/L H2O2l mL启动反应，37 ℃水浴加热反应30 min，以蒸馏水为参照，在510 nm下测量吸光值。以不添加H2O2的溶液为待测溶液的本底吸收值。清除率计算公式如下：
其中：A0：空白对照液的吸光度；Ax：加入胶原多肽后的吸光度；Ax0：不加显色剂H2O2的待测溶液本底的吸光度。
2.6.2.3 二苯代苦味酰自由基(DPPH)清除能力测定
具体方法[5,7]为，取5 mL离心管加入不同浓度胶原多肽溶液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，混匀避光反应20 min，在517 mn测得吸光值。以乙醇与不同浓度胶原多肽溶液等量混合液为对照管，DPPH溶液与去离子水等量混合后为空白管，清除率计算公式如下所示：
其中：Ax：加入待测样品后的吸光度；Ax0：待测样品与乙醇混合液的本底吸光值；A0：DPPH溶液与去离子水等量混合液的吸光值。
2.7 FBCP的皮肤刺激及眼刺激评价
2.7.1 多次皮肤刺激实验
采用自体对照方式，选择健康、成年、皮肤无损的白色家兔4只，试验前24 h用8%硫化钠将试验动物背部脊柱两侧背毛去除，去除面积左右各约3 cm×3 cm，将0.5 mL 50%(W/V)双斑东方鲀鱼皮胶原多肽溶液涂抹于一侧，另一侧作为空白对照，每天涂抹一次，涂抹后清洗观察皮肤状态，连续涂抹观察14天。第二天开始，每次涂抹前剪毛，用水清除残留受试物。涂抹1 h后观察结果，根据2015年版《化妆品卫生规范》[8]中皮肤刺激性反应评分标准对实验结果进行评分，计算给药动物积分均值，并对照皮肤刺激强度评分表判定皮肤刺激强度。
2.7.2 急性眼刺激试验
按照《化妆品卫生规范》2015版所示方法[8]进行测定，试验开始前24 h对受试动物眼睛进行检查，选用眼睛健康的受试动物，将50%(W/V)双斑东方鲀鱼皮胶原多肽溶液滴入受试动物一只眼睛结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1 s，另一侧眼睛作空白对照对照，30 s后用水安全流速冲洗30 s。滴入受试物后分别l、24、48、72 h以及第4天、第7天对受试动物眼睛进行检查，根据眼损害的评分标准表记录受试动物眼刺激反应进行积分，若观察72 h未出现刺激反应，即可终止试验。若发现眼刺激作用且7天内不可恢复，则为确定该损害的可逆性或不可逆性，需延长观察时间。根据受试动物角膜、虹膜或结膜分别在24、48或72 h观察点的刺激反应的最高积分和恢复时间，根据眼刺激反应分级表确定受试物对眼的刺激强度。
3 结果与讨论
3.1 双斑东方鲀鱼皮基本组分分析
双斑东方鲀鱼皮中，胶原蛋白含量占鱼皮的23.80%，占粗蛋白的88.08%(表2)。可见胶原蛋白是双斑东方鲀鱼皮的主要蛋白质，具有极高的利用价值，这为提取胶原多肽及研究河鲀鱼皮胶原多肽活性提供了研究基础。Zhang等[9]测定了暗纹东方鲀鱼皮基本成分：水分含量75.65%、粗蛋白含量96.53%(干重)、胶原蛋白含量88.50%(干重)，胶原蛋白占总蛋白含量的91.68%。任俊风测定红鳍东方鲀鱼皮基本成分，总蛋白含量97.3%，胶原蛋白含量87.6%，胶原蛋白占总蛋白含量的90%[10]。本研究结果与文献报道其他品种河鲀鱼皮基本成分结果相似，这间接表明了本研究结果的真实可靠性，亦表明双斑东方鲀鱼皮是胶原蛋白的良好来源，也为后续胶原多肽的提取实验奠定了良好的基础。
表2 双斑东方鲀鱼皮基本成分
3.2 FBCP提取单因素分析
结果如图1所示，伴随温度的升高，肽得率呈现先增加后下降的趋势。在45～50 ℃的温度范围内，反应温度的升高促使酶促反应速度加快，能高效酶解河鲀鱼皮，当温度高于50 ℃时胶原多肽得率显著降低。随着酶解时间的延长，肽得率逐渐上升，当酶解时间大于4 h时，肽得率无明显差异。因此初步确定4 h为适宜酶解时间。在pH值为9.0时肽得率达到最高，低于9.0或高于9.0肽得率均有所下降。随着加酶量增加，肽得率呈现一种先上升后下降的趋势。酶添加量为8 000 U/g时，肽得率达到最大值，由此选择8 000 U/g为酶解反应的适宜加酶量。因此，最终选择温度50 ℃，酶解4 h，pH9.0，8 000 U/g的加酶量作为正交实验的基础。
图1 酶解条件对肽得率的影响
3.3 FBCP正交试验分析
通过正交试验分析，可知该实验中对肽得率的影响主次顺序为温度>加酶量>酶解pH值>时间(表3)。对正交试验进行方差分析可知(表4)，温度、加酶量、酶解pH三因素均达到极显著水平，酶解时间对肽得率无显著影响，结合单因素实验结果和时间成本双重方面考虑，选择酶解时间为4 h，因此通过极差分析得出的河鲀鱼皮胶原多肽的最佳提取工艺为A2B3D2C2，即料液比1∶10、酶解温度50 ℃、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解时间4 h。采用上述工艺条件进行实验验证，三次平行实验测得的双斑东方鲀鱼皮胶原多肽的提取率分别为39.93%、39.65%、39.37%。
表3 正交实验分析表
表4 方差分析表
3.4 双斑东方鲀鱼皮胶原多肽在化妆品中的功效性研究
3.4.1 吸湿保湿功效测定
在高湿度环境(RH=70%)和低湿度环境(RH=40%)中，不同试样的吸湿率都随时间的推移而逐渐增大(图2)，说明各试样均具有良好的吸湿性。吸湿10 h后，甘油的吸湿率最高，其次为FBCP1，分别为4.54%±0.12%(RH=40%)和4.13%±0.08%(RH=70%)，FBCP1的吸湿率均高于其余胶原多肽，且FBCP1的吸湿率在不同湿度环境下变化不显著。由各试样的保湿率测定结果可知，在RH为40%和70%环境下，各试样具有一定的保湿能力。甘油保湿率最高，FBCP各组分中FBCP1较其余胶原多肽同样具有较好的保湿效率。
图2 不同湿度条件下吸湿率与保湿率测定
从上述吸湿保湿活性测定结果看出，四种组分中FBCP1具有更优越的吸湿性和保湿性。吸湿性是物质吸附或摄取水分的能力，保湿性是物质保持水分的能力，多肽可通过氨基酸侧链和蛋白质的肽键与水分子间的相互作用，防止水分蒸发，是良好的吸湿和保湿剂[11]。不同多肽分子对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同[12]。FBCP1分子量小，可能结构上相较于其他三种组分暴露出更多的亲水基团(氨基、羧基和羟基等)，对水分子结合力强，吸收水分和保持水分的能力也较大。
3.4.2 抗氧化功效测定
表5 不同胶原多肽及谷胱甘肽自由基清除IC50比较
图3 FBCP对自由基的清除作用
3.5 双斑东方鲀鱼皮胶原多肽多次皮肤刺激及眼刺激测定
3.5.1 多次皮肤刺激实验
多次皮肤刺激试验结果如下表所示，涂抹FBCP溶液14天后，4只受试兔皮肤均未见红斑和水肿，计算获得每天每只动物的积分均值为0，因此涂抹50%双斑东方鲀胶原多肽溶液对皮肤无刺激性。
表6 FBCP皮肤刺激性测定
3.5.2 急性眼刺激实验
急性眼刺激实验结果如下表所示，滴入50%(W/V)FBCP溶液后，3只受试兔眼睛的结膜未见充血，角膜未见浑浊异常，虹膜正常，观察点的刺激反应的最高积分均为0，因此滴入50%双斑东方鲀胶原多肽溶液对眼无刺激性。
表7 FBCP急性眼刺激测定
本研究通过多次皮肤刺激实验和急性眼刺激实验等体内实验测定FBCP的刺激性，实验结果均表明FBCP无刺激性。大量研究已证实了鱼源水解胶原多肽的无刺激性，Li等[16]开展了罗非鱼鱼皮胶原多肽复配润肤霜的安全性研究，实验结果表明添加罗非鱼鱼皮胶原多肽的润肤霜无任何刺激作用，Zhou等[17]研究了口服小分子鱼胶原蛋白粉对改善女性面部肤质的有效性和安全性，受试组面部皮肤的细纹、毛孔、纹理、紫质、水份、油脂改善明显，且无明显不良反应，具有较好的安全性和有效性。上述实验均表明鱼皮胶原多肽作为护肤品原料的可行性，这为后续研制开发双斑东方鲀鱼皮胶原多肽化妆品奠定了基础。
4 结论
本研究利用现代酶学技术，通过单因素和正交实验，确定了制备具有较高肽得率的FBCP的最佳酶解工艺条件：碱性蛋白酶为水解酶，料液比1∶10、酶解温度50 °C、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解时间4 h。本研究提取的FBCP在抗氧化、体内外保湿方面均有显著效果。研究表明，FBCP1(<1kD)具有最佳的自由基清除能力和保湿吸湿能力。同时，FBCP不具有皮肤刺激性和眼刺激性，作用温和，这为将来用于化妆品的添加剂提供理论基础。
