凤丹愈伤组织培养体系建立及丹皮酚含量测定

王若馨，纪楠楠，王华芳*

1北京林业大学林木育种国家工程实验室；2北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083

凤丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)属芍药科芍药属牡丹组(Paeoniasect.Moutan)杨山牡丹变种[1]，明末崇祯年间安徽铜陵县开始引种栽培沿用至今[2]。凤丹根皮(丹皮)的有效成分丹皮酚为我国传统道地药材，已入《中国药典》[3]，是六味地黄丸等的主要成分，具有清热凉血、活血化瘀、抗菌消炎、镇静降温、解痉、抗动脉粥样硬化、利尿、抗溃疡[4-6]等多种药理作用，是植物药研究的热点之一。天然丹皮酚主要取自凤丹根皮，道地药材局限于安徽铜陵，田间栽培需不少于5年，生产周期长且占用土地多等诸多因素的限制[7]。化学合成法生产丹皮酚操作简便，成本低廉，但化学过程产生的少量副产物，长期服用可能影响人体健康[8]。细胞工程技术根据生物学和工程学原理，以细胞为生物反应器生产丹皮酚，有效减少地域依赖和自然因素限制，缩短生产周期，提高生产效率以满足社会的健康需求，是丹皮酚生物技术制药发展的方向[9]。

目前，植物细胞工程技术制药途径主要通过建立愈伤组织或悬浮细胞培养体系，生产离体细胞用于提取药用成分[10]，因此建立凤丹愈伤组织培养体系为丹皮酚规模化制取奠定基础。凤丹愈伤组织培养体系的研究报道始于2002年[11]，随后常以叶柄[12]、茎段[13]等为外植体获得凤丹愈伤组织。Wei[12]以单因素试验建立凤丹愈伤组织增殖体系，增殖系数达2.86，并且发现培养基中添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 1.0 mg/L时丹皮酚含量最高，添加高浓度Cu2+较利于丹皮酚积累。Zhang[13]以单因素试验证实适量浓度的Ca2+、Cu2+及Phe等可提高凤丹愈伤组织中丹皮酚的含量。目前，凤丹愈伤组织培养体系依然存在易污染、易褐化、增殖缓慢等问题，阻碍了次生代谢产物丹皮酚的生产；并且未见关于凤丹愈伤组织生长曲线及确定丹皮酚取材时期的相关研究，因此无法进行规模化继代及丹皮酚生产参数设计。

本研究以凤丹种子胚为外植体，优化愈伤组织培养体系，包括培养基类型、植物生长调节剂、有机添加物、pH值、琼脂浓度及继代周期等影响因素；筛选愈伤组织增殖最佳条件，建立培养体系；测定愈伤组织在培养条件下的生长和丹皮酚含量，基于生长曲线，确定丹皮酚积累最佳培养周期和收获期，为细胞工程生产丹皮酚提供必需基础。

1 材料与方法

1.1 材料

凤丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)母株种植于北京顺义种植基地(北纬40.2°，东经116.5°，年平均降水量610 mm，年平均气温11.5 ℃，最低温度-19.1 ℃，最高温度42.0 ℃)。2017年8月选择生长健壮、无病虫害母株，采集成熟饱满的凤丹种子，室内阴干，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 无菌培养体系的建立

外植体表面消毒以70%乙醇(V/V)消毒时间、消毒剂有效氯浓度及消毒时间设计3因素3水平L9(34)正交实验，凤丹种子剥除种皮置于250 mL培养瓶内，纱布封口，自来水冲洗20 min。于超净工作台上，70%乙醇溶液浸泡0.5、1.0、2.0 min，以有效氯浓度0.5%、1.0%、1.5%的二氯异氰尿酸钠消毒液(含0.1%吐温-80)浸泡10、20、30 min，无菌水清洗3次，每次3 min。无菌滤纸沥干表面水分，接种在MS培养基上，按泊松分布，每处理接种30粒去皮种子，重复3次，14天后统计去污染率。培养条件为24±1 ℃，黑暗培养。

去污染率=(1-污染种子数/接种种子数)

×100%

1.2.2 凤丹胚诱导愈伤组织

以MS培养基为基本培养基，分别添加6-BA 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，2,4-D 2.0 mg/L，蔗糖30 g/L，pH 6.3，琼脂6 g/L。在超净台上，用解剖刀将凤丹去皮种子切开，取出胚，接种在上述培养基上。按泊松分布，每处理接种30个胚，重复3次，30天后统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率=发生愈伤组织的胚个数/

接种的胚个数×100%

注：愈伤组织块≥0.5 cm×0.5 cm×0.5cm计为一个发生事件。

1.2.3 愈伤组织的增殖

1.2.3.1 培养基、6-BA及NAA浓度优化

选取生长状况良好(乳白色、质地紧实，生长迅速)的愈伤组织为培养材料，以基本培养基类型、细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度设计3因素3水平L9(34)正交实验，基本培养基MS、1/2 MS、改良WPM[11]，6-BA 0.6、1.2、1.8 mg/L，NAA 0.6、1.2、1.8 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8。按泊松分布，每处理接种30块愈伤组织，在超净工作台上，将愈伤组织块置于分析天平上称重，每块0.1 g左右，重复3次，30天后统计愈伤组织增殖倍数及褐化率。

增殖倍数=(30天后愈伤组织质量-接种

时的质量)/接种时的质量

褐化率=褐化的愈伤组织块数/

接种的块数×100%

1.2.3.2 其他条件优化

采用单因素实验，确定水解酪蛋白CH(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L)、pH值(4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3、7.8、8.3)、琼脂(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 g/L)、继代周期(20、25、30、35、40天)对愈伤组织增殖的影响及适宜条件。选择生长旺盛、有光泽的愈伤组织，切成每块0.1 g左右，接种在不同的愈伤组织增殖培养基上，按泊松分布，每处理接种30块愈伤组织，重复3次，30天后统计愈伤组织增殖倍数及褐化率。

1.2.4 愈伤组织生长过程中丹皮酚含量测定

丹皮酚含量的测定方法参考Yang等[14]的方法。以上述优化的最佳愈伤组织增殖体系，分别于接种5、10、15、20、25、30、35、40天，去除表面琼脂，称量愈伤组织鲜重，50 ℃烘干至恒重后于4 ℃保存，以培养时间为横坐标，愈伤组织鲜重和丹皮酚含量为纵坐标绘制曲线。

称取约0.1 g烘干后的愈伤组织于研钵中研磨成粉末，无水乙醇定容至10 mL，混匀。50 ℃水浴2 h，100 W超声处理30 min，静置过夜，吸取0.1 mL样品上清液，稀释300倍后，分光光度计测定274 nm处吸光值，每个样品3个生物学重复，3个技术重复，以丹皮酚标准品(购于试剂公司，纯度>98%)绘制标准曲线，计算样品的丹皮酚含量。

1.2.5 数据分析

以EXCEL 2010计算数据标准误差，IBM Statistical Package for Social Sciences 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析和Duncan多重检验。

2 结果与分析

2.1 凤丹种子表面消毒

凤丹种子表面消毒的结果如表1所示，消毒剂有效氯浓度及消毒时间对凤丹种子去污染率的影响显著，而70%乙醇消毒时间则影响不显著(P<0.05)。消毒剂有效氯浓度1.0%和1.5%去污染率显著高于0.5%，而1.0%与1.5%的去污染率无显著性差异；种子消毒剂消毒20和30 min的去污染率显著高于消毒10 min，20与30 min对去污染率无显著性影响。综合考虑经济及时间因素，凤丹种子表面消毒的最佳组合为70%乙醇消毒2.0 min，有效氯浓度1.0%的二氯异氰尿酸钠消毒液浸泡20 min，去污染率高达97.78%。

表1 70%乙醇消毒时间、有效氯浓度及消毒时间对凤丹种子表面消毒的影响

2.2 凤丹胚愈伤组织诱导

植物生长调节剂6-BA浓度显著影响凤丹胚愈伤组织诱导率(P<0.05)(图1)，胚诱导愈伤组织的过程中，接种在培养基上3天后子叶张开，11天后出现愈伤化，随着培养时间延长愈伤组织不断增殖(图2)。6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L对愈伤组织诱导率无显著性差异，且均显著高于6-BA 2.0 mg/L；其中，培养基中添加6-BA 1.5 mg/L的愈伤组织诱导率最高，达90.00%。

图2 凤丹成熟胚愈伤组织诱导过程

图1 6-BA浓度对凤丹胚诱导愈伤组织的影响

2.3 凤丹胚愈伤组织增殖

2.3.1 培养基、NAA及6-BA浓度对愈伤组织增殖的影响

培养基类型、6-BA及NAA浓度对愈伤组织增殖的影响如表2所示，培养基对愈伤组织增殖倍数影响显著，而6-BA和NAA浓度影响不显著(P<0.05)，在MS和改良WPM培养基上，愈伤组织增殖倍数显著高于1/2 MS，但MS和改良WPM无显著性差异。培养基类型对愈伤组织褐化率均具有显著性影响(P< 0.05)。在MS培养基上的愈伤组织褐化率显著高于1/2 MS和改良WPM，但在1/2 MS和改良WPM上的差异不显著，在添加6-BA 1.8 mg/L的培养基上的褐化率显著高于0.6、1.2 mg/L。由表2得，处理7增殖倍数显著高于其他处理，褐化率与处理5差异不显著。综合考虑，改良WPM培养基、6-BA 1.8 mg/L、NAA 0.6 mg/L最适于愈伤组织的增殖培养，其增殖倍数为2.41。

表2 培养基、6-BA及NAA浓度对愈伤组织增殖的影响

2.3.2 CH对愈伤组织增殖的影响

水解酪蛋白(CH)浓度对愈伤组织的增殖影响显著(图3)，而对褐化率无显著性影响(P<0.05)。随着CH浓度增加，愈伤组织增殖倍数呈现先增加后降低的趋势，CH 0.3 g/L和0.4 g/L的增殖倍数显著高于对照(不添加CH)，CH 0.4 g/L的增殖倍数3.18，达到最大，褐化率则最低。

图3 CH对愈伤组织增殖的影响

2.3.3 pH对愈伤组织增殖的影响

培养基pH值对愈伤组织的增殖及褐化率均具有显著性影响(图4，P<0.05)。随着pH值增加，培养基硬度增加，愈伤组织的增殖倍数先增加后降低，pH7.3的增殖倍数显著高于pH4.8～6.3及7.8～8.3，而pH7.3与6.8之间无显著性差异，但以pH7.3时的增殖倍数最大为3.42；pH4.8的褐化率最高且显著高于6.8～8.3，而5.3～8.3之间的褐化率差异不显著，培养基pH7.3较适于愈伤组织的增殖培养。

图4 pH值对凤丹愈伤组织增殖的影响

2.3.4 琼脂浓度对愈伤组织增殖的影响

琼脂浓度对愈伤组织增殖倍数和褐化率均有显著影响(图5，P<0.05)。愈伤组织的增殖倍数随着琼脂浓度增加呈现先增加后降低的趋势。愈伤组织的增殖倍数在添加琼脂5.0 g/L的培养基上最高，显著高于7.0～9.0 g/L，而琼脂5.0 g/L与4.0、6.0 g/L的增殖倍数差异不显著。愈伤组织褐化率随琼脂浓度增加呈降低趋势，培养基中添加4.0 g/L琼脂时的褐化率最高，5.0～9.0 g/L的褐化率差异不显著。综合考虑，培养基中添加琼脂5.0 g/L更适于愈伤组织的增殖培养，增殖倍数达3.51。

图5 琼脂浓度对凤丹愈伤组织增殖的影响

2.3.5 继代周期对愈伤组织增殖的影响

愈伤组织继代周期对增殖倍数影响显著，但对褐化率影响不显著(图6，P<0.05)。随着培养时间延长，愈伤组织的增殖倍数呈现先增加后趋于平稳，培养25～45天的增殖倍数无显著性差异但显著高于20天，随着培养时间延长愈伤组织趋于颜色灰暗褐变。培养25～35天时，愈伤组织呈乳白色，增殖较快(图7)，增殖倍数达3.53～3.67。培养25～35天之间的增殖倍数无显著性差异，而本研究中25天为丹皮酚最佳收获期，所以在实际生产中以25天为最佳继代周期。

图6 继代周期对愈伤组织增殖的影响

图7 凤丹愈伤组织增殖情况

2.4 愈伤组织的丹皮酚含量

以丹皮酚标准品为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，拟合的标准方程为：y=0.407 3x-0.003 7，R2= 0.998 1，表明标准品梯度浓度线性关系好。愈伤组织鲜重随培养时间的增长呈S型曲线，如图8所示，培养10～30天的愈伤组织生长处于对数生长期，此时的细胞已适应新的培养环境，细胞快速增殖；30～45天趋于稳定期，细胞生长缓慢。丹皮酚含量的测定表明，愈伤组织培养0～20天，丹皮酚含量在1.50 mg/g上下波动，20～25天丹皮酚含量则迅速增加至最高，为1.75±0.13 mg/g，之后随着培养时间延长丹皮酚含量呈下降趋势。愈伤组织培养25天，适合收获用于提取丹皮酚。

图8 愈伤组织生长曲线及丹皮酚含量的积累

3 讨论

牡丹外植体表面消毒常以升汞(HgCl2)[15]和次氯酸钠[15,16]作为消毒剂，升汞剧毒，致癌、致突变，废液污染环境。次氯酸钠虽为环境友好型消毒剂，但常温下容易分解(半衰期大约为3个月)，有效剂量和消毒时间难以掌握。本研究采用有效氯浓度1.5%的环境友好型消毒剂二氯异氰尿酸钠水溶液(年损失率约2%)浸泡凤丹去皮种子30 min，去污染率高达98.89%，较传统消毒剂相比去污染率高、性质稳定，便于规模化生产应用。植物愈伤组织诱导常以叶片、茎段、种胚等为外植体。叶片、茎段等高度分化，脱分化过程比种胚复杂且难度大，种胚生理年龄小，分化程度低、诱导率高常被应用[11]。Wei[12]将凤丹种胚接种在含6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培养基上，愈伤组织诱导率为79.06%。本研究凤丹种胚愈伤组织诱导率随6-BA浓度从0.5 mg/L升高至1.5 mg/L逐渐增至最高，达90.00%，较79.06%的种胚愈伤诱导率[12]大幅提升，表明6-BA与2,4-D的组合更适用于凤丹愈伤组织的诱导。但6-BA浓度上升至2.0 mg/L，则诱导率显著下降(图1)，揭示了6-BA浓度诱导凤丹种胚愈伤发生的有效范围。

培养基组成对植物细胞生长分化至关重要。据报道，基本培养基MS、1/2MS和WPM对凤丹愈伤组织褐化无显著性差异[12]。本研究发现培养基类型的影响显著(表2)，MS培养基上的愈伤组织褐化率显著高于1/2 MS和改良WPM，与前人结果不一致，改良WPM和1/2 MS培养基无机盐浓度较MS培养基低，褐化率低，有利于愈伤组织的增殖[17]，相关研究有待进行。水解酪蛋白(CH)可为愈伤组织生长提供有机氮源。培养基中添加CH 0.4 g/L促进牡丹(P.suffruticosa)叶片愈伤组织的增殖[18]。本研究添加CH 0.4 g/L，凤丹愈伤组织增殖系数由2.41提高至3.18，且对褐化率没有显著影响，该结果与文献一致。CH浓度提高到0.6 g/L则增殖倍数降低(图3)，表明CH的添加有最佳有效浓度。

培养基pH值、琼脂浓度、继代周期等也影响愈伤组织增殖，‘乌龙捧盛’愈伤组织在中性偏酸的培养基上生长较好，褐化率较低[19]。凤丹愈伤组织在中性偏碱(pH 7.3)的培养基上增殖效果最好(图4)。琼脂0.7%为诱导花生(ArachishypogaeaL.)愈伤组织的最佳浓度[20]，而0.5% 为凤丹愈伤组织增殖最佳浓度，褐化率较低(图5)。继代周期过短，增殖效果不佳，时间过长，则愈伤组织褐化死亡。以上实验结果表明物种之间存在明显的培养条件差异，生物的普遍性必须与特定植物的特殊性结合才能获得解决问题的最佳技术方案。

凤丹愈伤组织生长曲线和丹皮酚积累曲线是决定愈伤组织收获期的依据。图8显示培养25天，丹皮酚含量最高。实际生产时可考虑培养25天时，及时继代使愈伤组织块降低至10天的鲜重，使其长期处于快速增殖的线形生长期，从而最大程度促进愈伤组织增殖。

丹皮天然产物丹皮酚是《中国药典》丹皮质量检测指标之一，凤丹天然产物还有芍药苷等多种成分，各种次生代谢物质最佳培养体系还需分别研究。合适的培养基类型、环境因素、植物生长激素和诱导子都影响次生代谢产物的积累。据报道，红光和蓝光可以促进凤丹愈伤组织丹皮酚的积累[13]。有关的研究必将根据需要不断深入，凤丹细胞作为生物反应器工场将生产人类所需的多种产品服务社会。

4 结论

凤丹愈伤组织培养体系是植物细胞工程生产天然产物丹皮酚的基础，在此基础上可进行高产细胞系的诱变与选择、细胞培养条件的调控、代谢反应前体物质的添加、诱导子的应用、培养技术的改进等研究，从而实现克服道地药材地域、生长周期长和土地占用空间大等局限，使生产满足社会生活需要。本研究以凤丹种胚为外植体，建立并优化凤丹愈伤组织细胞生产丹皮酚的培养体系。研究表明，去皮种子建议以70%乙醇(V/V)浸泡2.0 min，有效氯1.0%的二氯异氰尿酸钠溶液浸泡20 min去污染效果最佳；种胚愈伤组织诱导采用6-BA 1.5 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L的MS培养基；愈伤组织采用含6-BA 1.8 mg/L、NAA 0.6 mg/L、蔗糖30 g/L、水解酪蛋白0.4 g/L、琼脂5 g/L、pH 7.3的改良WPM培养基暗培养25天，增殖倍数高且褐化率低；基于愈伤组织生长和丹皮酚积累曲线，培养25天适于收获愈伤组织生产丹皮酚。以上研究结果为天然产物丹皮酚的细胞工程生产提供技术基础。