基于网络药理学和分子对接探索荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的潜在机制

黄少杰，牟 菲，李 飞，陈海霞,2，王文军,2，马 阳,2，王婧雯*，丁 一*

1空军军医大学西京医院药剂科，西安 710032；2陕西中医药大学药学院，咸阳 712000

2019年12月，武汉爆发了由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎。患者以发热、乏力、干咳为主要表现，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血障碍等[1]。截止2020年5月26日24时，我国已累计报告确诊病例82 993例，现有确诊病例79例(其中重症病例5例)，累计治愈出院病例78 280例，累计死亡病例4 634例[2]，同时海外感染发病持续上升，现累计确诊病例已超过550万例。这是21世纪短短20年间冠状病毒在2003年严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、2015年中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)之后第三次大规模流行。冠状病毒每次大规模流行都严重威胁人类健康，给社会和经济的发展带来严峻挑战和沉重负担。然而，临床对治疗冠状病毒引起的肺炎尚无特效药，多采用支持治疗为主[3]，因此相关药物研究迫在眉睫。

自新型冠状病毒疫情发生以来，根据各省市自治区相关诊疗方案和建议[4]，中医药已经广泛应用于新型冠状病毒的治疗，其中多省市推荐中药中用到了荆芥、防风。荆芥(Schizonepetae Herba，SH)为唇形科植物荆芥(NepetacatariaL.)的干燥地上部分。其味辛，性微温，具有解表散风，透疹，消疮之功效[5]。防风(Saposhnikoviae Radix，SR)为伞形科植物防风(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.)Schischk.)的干燥根，味辛、甘，性微温。具有祛风解表，胜湿止痛，止痉之功效[6]。荆芥和防风是《宣明论方》所记载的防风通圣丸的君药，二者作为散风寒、祛风胜湿的药对收载于《施今墨药对》。荆芥和防风均具有解热、镇痛、镇静、抗菌、抗炎、止血等作用[7,8]。

自2008年提出以来[9]，网络药理学作为一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科，由于其整体性、系统性的研究方法和注重药物间相互作用的特点与中医药学多靶点、多通路的作用特点相吻合，已经成为系统性分析中药复方多靶点，多通路作用机制的有效工具。多项研究利用网络药理学探索中药作用机制已经取得成功[10]。综上，本文拟通过网络药理学和分子对接方法探究荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的潜在机制，为荆芥-防风的临床应用提供参考。

1 方法

1.1 荆芥-防风成分筛选、靶点预测及网络构建

在TCMSP[11](http://tcmspw.com/tcmsp.php)、ETCM[12](http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)和BATMAN-TCM[13](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库分别以“荆芥”、“防风”、“JingJie”、“FangFeng”为关键词，收集荆芥-防风中化学成分，并以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为吸收、分布、代谢、排泄(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)参数筛选出活性成分，并在数据库中收集活性成分相关靶点。利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据将收集到的靶点转换为Uniprot Entry格式，并通过Cytoscape3.7.1软件构建成分靶点网络，分析网络拓扑参数，确定关键节点，分析荆芥-防风治疗冠状病毒肺炎的物质基础。

1.2 冠状病毒肺炎靶点收集

应用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，OMIM数据库(https://www.omim.org/)，NCBI Gene数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)输入关键词“coronavirus pneumonia”收集冠状病毒肺炎相关靶点。并通过Uniprot数据库将靶点名称统一校正为Uniprot Entry格式。将活性成分作用靶点与冠状病毒肺炎相关靶点取交集，得到荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎关键靶点。

1.3 关键靶点蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络构建

将关键靶点导入蛋白质相互作用分析数据库STRING(https://string-db.org/)，选择“Homo sapiens”，设定置信度≥0.700，分析关键靶点的相互作用，并将收集的数据导入Cytoscape3.7.1构建PPI网络，分析网络拓扑参数，筛选收集度值(degree)高于平均值的重要靶点。

1.4 GO功能富集和KEGG通路富集

为探索关键靶点的生物功能和作用通路，将关键靶点上传至DAVID数据库[14](https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。并以P<0.05为条件进行筛选，选取基因数目排名前20的通路，利用ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)工具在线绘制气泡图。利用Cytoscape软件构建“成分-靶点-通路”网络，分析网络拓扑参数，探究成分-靶点-通路之间的关系。

1.5 分子对接验证

通过检索TCMSP数据库获得活性成分mol2格式化学结构，检索RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得蛋白晶体结构，运用Pymol软件进行去水、加氢等操作后保存为PDB格式，应用Autodock[15]软件对“活性成分-作用靶点”网络中的度值大于平均值的化学成分和PPI网络中的重要蛋白及SARS病毒受体血管紧张素转化酶II(angiotensin converting enzyme II，ACE2)、COVID-19 main protease(RDS ID：6LU7)进行分子对接。通过binding energy的值评价活性成分和关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 荆芥-防风活性成分筛选及“成分-靶点”网络构建

通过检索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库，在TCMSP数据库检索到荆芥化学成分159种，防风中化学成分173种；在ETCM数据库中检索到荆芥化学成分32种，防风化学成分32种；在BATMAN-TCM中检索到荆芥化学成分67种，防风化学成分71种。通过设置OB≥30%，DL≥0.18，防风中筛选出活性成分20种，荆芥中活性成分11种，其中两者共有活性成分3种(表1)，并获得活性成分相关作用靶点402个。通过Cytoscape软件构建“成分-靶标”网络(图1)。通过分析网络性质，活性成分M01(luteolin)、M03(quercetin)、M04(wogonin)、M05(beta-sitosterol)、M07(stigmasterol)、M08(clionasterol)、M11(hesperetin)、M24(5-O-methylvisamminol)、M25(schizonepetoside B)的度值(degree)高于平均值，说明这些成分可能是荆芥-防风抗冠状病毒肺炎的关键成分。

表1 荆芥-防风中活性化合物的基本信息

图1 荆芥-防风药对成分-靶标网络图

2.2 药物靶点基因筛选及关键基因获取

通过检索GeneCards数据库、OMIM数据库、NCBI Gene数据库删除重复项后得获冠状病毒肺炎相关靶点252个，与活性成分相关靶点取交集后共获得56个关键靶点(图2)。

图2 活性成分靶点(A)和冠状病毒肺炎靶点(B)Venn图

2.3 PPI网路构建与分析

将56个关键靶点导入STRING数据库，基因类型改为“Homo sapiens”，并将置信度设置为high confidence 0.700，获得PPI网络图TSV格式文件，将其导入Cytoscaope软件进行可视化处理(图3)。图3中共涉及54个节点(node)，399条边(edge)。PPI网路图中，节点根据度值从最低点以顺时针排列为圆形，节点的大小代表betweenness centrality大小，节点颜色从淡绿色渐变至橙色表示closeness centrality从小到大变化，edge的粗细从粗到细表示edge betweenness从大到小，利用edge颜色从淡绿色渐变至橙色表示combined score大小。共有23个蛋白度值高于平均值(表2)，其中度值前十的蛋白为IL6、TNF、MAPK1、TP53、IL1β、RELA、IL10、CXCL8、CCL2、ICAM1，说明这10种蛋白在网络中与其他蛋白相互作用较多，在网络中发挥了重要作用。

图3 56个关键靶点PPI网络图

表2 Degree值高于平均值的23个靶蛋白

2.4 GO功能富集和KEGG靶点通路富集分析

经过DAVID数据库分析，以P<0.05为条件共收集到176个生物过程(biological process)，47个分子功能(cell compound)，36个细胞组分(molecular function)和99条KEGG通路(图4)，所包含基因数最多的前20的通路详细信息结果见表3。将DANID分析结果导入Cytoscape构建“成分-靶标-通路”网络图，见图5。GO功能富集表明，荆芥-防风药对可通过调节炎症反应(inflammatory response)生物过程发挥作用，同时还作用于正调控RNA聚合酶II启动子转录(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、免疫应答(immune response)、负调控凋亡过程(negative regulation of apoptotic process)、凋亡过程(apoptotic process)等生物过程。KEGG通路分析表明荆芥-防风药对可能通过TNF信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)等信号通路发挥抗冠状病毒肺炎的作用。“成分-靶标-通路”网络图分析结果显示，luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol四种化合物在网络图中度值高于平均度值，提示这些化合物可能在荆芥-防风药理作用的发挥中扮演重要角色。

图4 GO功能富集和KEGG通路富集

表3 基因数目前20的KEGG通路基本信息

图5 成分-靶标-通路网路图

2.5 分子对接验证

利用Autodock软件，选取“成分-靶标-通路”网络图中度值高于平均值的四个化合物(luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol)与PPI网络中度值排名前五的靶点(IL6、TNF、MAPK1、IL1β、TP53)及ACE2、COVID-19 main protease进行对接，除M01、M03、M04与TP53对接后binding energy大于-5 kcal/mol外，其余结果均小于-5 kcal/mol，说明活性成分和靶蛋白能形成稳定的结合，如表4所示。利用Pymol软件对活性化合物与ACE2、COVID-19 main protease结果进行可视化处理结果如图5所示A、B、C、D分别为luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol与ACE2蛋白对接模式图，E、F、G、H分别为luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol与COVID-19 main protease蛋白对接模式图。

表4 活性成分与潜在靶点对接结果

图6 活性成分与ACE2、COVID-19 main protease的分子对接模式

3 讨论

荆芥和防风为常见疏风解表、清热退热类中药，具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热等药理作用[16]。自新型冠状病毒疫情发生以来，荆芥和防风被广泛的应用于冠状病毒肺炎的治疗，有较为满意的临床疗效，提高了临床治愈率[17]，然而其作用机制并不明确，同时缺乏分子水平实验研究。因此，深入研究分析荆芥-防风治疗冠状病毒肺炎作用机制，探索其潜在作用靶点，为荆芥-防风后续分子机制研究提供了方向，同时对临床应用具有重要意义。本文基于网络药理学和分子对接技术研究了荆芥-防风治疗冠状病毒肺炎的活性成分、潜在作用靶点和作用通路。发现荆芥-防风药对可能通过luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol等活性产物，作用于IL6、TNF、MAPK1、IL1β、TP53等靶点，调节炎症反应、正调控RNA聚合酶II启动子转录、免疫应答、负调控凋亡过程等生物过程，通过TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等发挥多成分、多靶点、多通路抗冠状病毒肺炎的药理作用。

PPI网络图参数显示，IL6、TNF、MAPK1、TP53、IL1β、RELA、IL10等23种蛋白度值高于平均值，说明其在PPI网络中与其他蛋白联系紧密、相互作用较强。其中，IL6、IL1β、TNF、IL10等炎性因子相关蛋白均具有较高的度值，处于网络的中心位置，这些靶点蛋白均参与呼吸道疾病的免疫应答和炎症过程，与炎症反应对呼吸道的刺激密切相关。一项最新的关于冠状病毒肺炎患者遗体解剖研究显示[18]，死者肺部损伤明显，炎性病变清晰，说明炎症反应在冠状病毒肺炎的病情发展中发挥了重要作用，荆芥-防风可能通过这些靶点发挥抗炎作用。Kindrachuk等[19]研究表明，靶向MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路的抑制剂无论是在病毒感染之前还是之后，都抑制冠状病毒的复制，KEGG富集结果同样显示，MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路富集结果具有统计学差异。HIF-1信号通路同样在维持肺泡上皮细胞稳态和疾病发病机制中发挥了重要作用[20]，与KEGG通路富集结果一致。说明荆芥-防风药对中活性物质可能通过MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和HIF-1信号通路发挥抗冠状病毒肺炎药理作用。

通过网络药理学筛选，我们发现luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol化合物在“成分-靶点-通路”网络中度值高于平均值。因此，我们将这四种成分与PPI网络中度值前五的分子进行对接，结果显示这四种成分与IL6、TNF、MAPK1、IL1β对接能量均小于-5 kcal/mol，beta-sitosterol与TP53对接结果小于-0.5 kcal/mol。说明荆芥-防风的活性化学成分可以和IL6、IL1β、TNF和TP53蛋白较稳定的结合。同时，已研究表明[21-24]，luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol均表现出较好的抗炎活性，表明这些成分在荆芥-防风药对抗炎作用中扮演了重要角色。由于冠状病毒肺炎为新发疾病，疾病靶点收录并不完整，我们将度值大于平均值的化学成分与SARS病毒ACE2和COVID-19 main protease进行了对接验证，发现四种化学与ACE2、COVID-19 main protease均取得较好对接结果。说明荆芥-防风活性物质可能于这两种蛋白结合发挥抗冠状病毒肺炎的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学的分析方法对荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的药效物质和作用靶点进行研究，并通过分子对接技术对筛选出的靶点进行验证，同时对接了活性物质与SARS病毒受体ACE2和COVID-19 main protease，发现了荆芥-防风潜在的抗冠状病毒可能性，为荆芥-防风临床应用与开发提供了支撑，也为课题组后续荆芥-防风活性物质筛选及作用靶点研究打下了基础。