嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

刘绒欢，郭慧琛，杜平，董虎，郭梦楠，孙世琪

·动物及兽医生物技术·

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

刘绒欢，郭慧琛，杜平，董虎，郭梦楠，孙世琪

中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 OIE/国家口蹄疫参考实验室，甘肃 兰州 730046

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs) 的特异性识别和递呈，为靶向疫苗研究奠定基础，利用反向PCR技术，将卵清蛋白(Ovalbumin，OVA) 第257–264位氨基酸(Amino acids，aa) 的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa，通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3，体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态，免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA，不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面，VLPOVA粒径比VLPs稍大。

口蹄疫病毒，嵌合型病毒样颗粒，OVA257-264，VP3

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD) 是由口蹄疫病毒(FMD virus，FMDV) 引起的急性、热性、高度传染性疾病[1]。FMDV属于小RNA病毒科的口蹄疫病毒属。完整FMDV为正二十面体对称结构，由各60个分子的VP1、VP2、VP3和VP4组成，FMDV的空衣壳或病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs) 由VP0 (VP4和VP2的前体)、VP1和VP3组成，其基因分别为909、633、660个核苷酸[2]。感染口蹄疫病毒后，动物的生长、产奶量和活动能力都会受到严重影响，感染动物的产品也不能流入市场，极大影响畜牧业的健康发展、对国家经济及社会均造成严重危害[3-4]。目前，预防口蹄疫以灭活疫苗为主[5]，但灭活疫苗存在生物安全风险，因此需开发更加安全的新型替代疫苗。

VLP是一种不含病毒核酸，形态类似病毒的空心颗粒，由于该颗粒不能自我复制，具有优越的安全性和免疫原性[6-8]。

重组杆状病毒表达的FMDV VLPs接种动物后可诱导产生一定的保护作用，但由于抗原量少且抗原靶向性弱，所以无法达到全病毒灭活疫苗的免疫效果[9-10]。为了增强免疫效果，将抗原与CpG或Poly (I︰C)、白细胞介素等佐剂配合使用，修饰性短肽与抗原连接也被作为促进免疫细胞活化和增强免疫效果的策略，卵清蛋白(Ovalbumin, OVA) 常被作为模式抗原[11-13]，其包含两个OVA短肽：OVA257-264肽和OVA323-339肽，分别诱导CD8+T细胞应答和CD4+T细胞应答。Lipford等研究发现，OVA257-264肽可与主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC) Ⅰ类分子结合，产生强烈的细胞溶解性CD8+T细胞应答，进而诱导CD8+T细胞增殖、分化为效应性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxicity T lymphocyte， CTL)[14]。HBsAgS VLPs中嵌入OVA257-264肽后可被常规树突状细胞(Conventional dendritic cell，cDC) 识别，通过MHCⅠ类抗原递呈途径递呈给CD8+T细胞，并引起CTL反应[15]。

FMDV的VP1、VP2和VP3的立体结构相似，均由8个β折叠桶组成，折叠桶之间由环结构相连[16]，研究显示在VP1的GH环插入HA和FLAG标签不影响重组病毒的拯救，提示结构上柔韧的环部可以容忍外源片段的插入[17-18]，但是FMDV的主要抗原位点和受体识别位点位于VP1的GH环，外源片段的插入有可能会影响病毒的感染性和抗原特性[19-20]，VP3的第171–181位氨基酸位于GH环[21-22]，对VP3的174、174和179位氨基酸的突变不影响重组病毒的拯救，也不影响病毒对受体的结合，提示该位点不是病毒感染和组装的必需氨基酸，有可能容忍外源片段的插入[23-25]。

基于OVA257-264可与MHCⅠ类分子靶向结合的特性，以及FMDV VP3 C端柔性环的特点，本研究在FMDV VP3的第171–172位aa或第173–174位aa嵌入OVA257-264，利用大肠杆菌表达VP3OVA融合蛋白，研究OVA257-264对VP3蛋白表达的影响和组装VLPs的影响，为提高VLPs抗原的特异性识别和递呈、研究靶向VLPs疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

pSMA-VP3、pSMK-VP0/VP1是在FMDV结构蛋白基因N端融合His标签和小泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-like modifier，SUMO) 基因的重组载体[26-27]。克隆菌大肠杆菌DH5α和表达菌BL21 (DE3)的感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和抗体

PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase、MutanBEST试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司。猪抗FMDV血清和FMDV结构蛋白SUMO-VP3、SUMO-VP0、SUMO-VP1由本实验室保存；SUMO蛋白酶购自Invitrogen公司；OVA257-264(SIINFEKL) 肽购自金斯瑞公司；兔抗OVA多克隆抗体购自Abcam公司；APC标记的抗鼠OVA257-264(SIINFEKL) 肽连接H-2Kb单克隆抗体购自Biolegend公司；辣根过氧化物酶(HRP) 标记的兔抗猪IgG抗体、HRP标记山羊抗兔IgG抗体、FITC标记的兔抗猪IgG抗体、染料DAPI购自Sigma公司。镍离子螯合树脂购自Roche公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 动物与细胞

小鼠骨髓源树突状细胞(Bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)分离于C57BL/6小鼠(雄，6–8周龄，SPF级)，用RPMI 1640培养基培养(Gibco)，并辅以10%灭能(56 ℃，30 min)胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS) (Sigma)、 100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(Gibco)、10 μmol/mL β-巯基乙醇(细胞培养级)、20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte- macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白细胞介素4 (Interleukin-4，IL-4) (R&D)，置于5% CO2培养箱培养。

1.4 引物的设计与合成

根据大肠杆菌密码子偏嗜性对OVA257-264的密码子进行优化。使用Primer Premier 5.0设计引物(表1)，由金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 嵌合OVA重组载体的构建

利用反向PCR方法，以质粒pSMA-VP3为模板，OVA171F/R或OVA173F/R为引物对，用PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase试剂盒扩增，将OVA257-264嵌入到重组质粒pSMA-VP3中。1.0%琼脂糖凝胶电泳后胶回收扩增片段。用MutanBEST试剂盒对目的片段基因进行磷酸化和连接。将连接产物转化至.DH5α感受态细胞。用引物对VP3-F/R进行PCR鉴定，将阳性质粒命名为pSMA-VP3OVA171或pSMA-VP3OVA173，并送金唯智生物科技有限公司测序。

1.6 重组菌的构建和诱导表达及纯化

将pSMA-VP3OVA171或pSMA-VP3OVA173转入表达菌.BL21 (DE3)，挑单克隆菌于5 mL LB (含100 μg/mL Amp) 培养基振摇过夜。取3 mL菌液接种于300 mL LB (含100 μg/mL Amp) 培养基振摇，待600约为0.7时，加IPTG诱导(终浓度0.5 mmol/L)，180 r/min室温振摇过夜，离心(6 000 r/min，15 min，4 ℃) 收集菌体沉淀，用20 mL 缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L咪唑，pH 8.5) 重悬，超声破碎15 min，离心(11 000 r/min, 30 min，4 ℃) 收集上清，按His标签蛋白纯化试剂盒说明书纯化蛋白，进行SDS-PAGE，比较诱导前后目的蛋白表达情况。

表1 引物序列

将pSMA-VP3OVA171或pSMA-VP3OVA173与pSMK-VP0/VP1共转入表达菌.BL21 (DE3)，挑单克隆菌于5 mL LB (含100 μg/mL Amp和Kan) 液体培养基中，振摇过夜。用引物对VP0-F/R、VP1-F/R和VP3-F/R，筛选VP3OVA、VP0和VP1基因阳性的克隆，取3 mL菌液接种于300 mL LB (含100 μg/mL Amp和Kan) 液体培养基中振摇，同上述单质粒表达步骤进行诱导、表达和纯化。

1.7 免疫印迹分析

将样品进行SDS-PAGE电泳，湿转(200 mA，2 h) 至硝酸纤维素膜上(NC膜)，5%脱脂奶粉封闭，分别用猪抗FMDV血清和兔抗OVA抗体孵育2 h，TBST洗膜(6 min/次×6次)，再分别用HRP标记的兔抗猪IgG抗体、HRP标记山羊抗兔IgG抗体孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光液，胶片曝光，显影，定影后，分析目的蛋白。

1.8 FMDV VLPs组装

将纯化的蛋白转至截留分子量为10 kDa的透析袋，参照说明书加入一定比例的SUMO蛋白酶透析(透析缓冲液为40 mmol/L Tris-HCl、 500 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2，pH 8.0)，获得嵌合病毒样颗粒VLPOVA，动态光散射检测VLPOVA的粒径和分散度。

1.9 透射电子显微镜(TEM)

取10 μL组装样品滴加至200目铜网碳支持膜上，室温吸附3 min，吸去多余液体，滴加5 μL 2%磷钨酸，室温孵育3 min，吸去多余液体，晾干，透射电镜(80 kV) 观察。

1.10 ELISA检测

使用间接夹心ELISA法检测样本，用猪抗FMDV血清包被酶标板，洗涤，加入被检样品，室温孵育30 min，洗涤，兔抗OVA一抗(1︰20 000)孵育；洗涤，HRP标记的山羊抗兔二抗(1︰10 000)孵育；洗涤，加入底物液，终止液终止反应，检测吸光度值。使用One-way ANOVA进行统计分析，0.01<<0.05为差异性显著，<0.01为差异性极显著。

1.11 激光共聚焦显微镜检测

分离BMDCs，将C57BL/6小鼠脱臼处死，75%乙醇消毒灭菌，取小鼠后腿股骨和胫骨，剔除肌肉，用新鲜RPMI 1640培养基冲洗，直至腿骨透明，轻吹打液体，尼龙筛过滤，离心 (1 200 r/min，10 min，4 ℃)，弃上清，1×红细胞裂解液重悬沉淀裂解5 min，离心，弃上清，完全培养基重悬细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，隔天半量换液。培养至第5天，收集细胞，以2×106个细胞/皿转至激光共聚焦培养皿中，加入不同样品作用2 h，4%多聚甲醛固定，加入1‰ Triton-100，PBS清洗，5% NBS封闭2 h，依次加入猪抗FMDV血清(1︰100)、FITC标记的兔抗猪IgG抗体(1︰200)、APC抗鼠OVA257-264(SIINFEKL)肽连接H-2Kb抗体(1︰50)，每次孵育1 h，PBS洗3次，加DAPI孵育30 min，清洗，激光共聚焦显微镜观察结果。

2 结果与分析

2.1 嵌合OVA重组载体的构建

以pSMA-VP3质粒为模板，用引物对OVA171F/R或OVA173F/R进行反向PCR，将OVA257-264嵌入至FMDV VP3蛋白的第171–172或第173–174 aa位点之间，扩增片段与线性化的pSMA-VP3大小一致。扩增片段经凝胶纯化、磷酸化、连接、转化，用引物对VP3-F/R进行PCR鉴定，扩增片段与VP3OVA预期大小684 bp相符，进一步测序确证，命名为pSMA-VP3OVA171和pSMA-VP3OVA173。

2.2 嵌合OVA重组蛋白的表达

将质粒pSMA-VP3OVA171或pSMA-VP3OVA173转入表达菌.BL21 (DE3)，IPTG诱导表达和纯化。结果显示，所表达的蛋白与SUMO-VP3OVA的预期大小37 kDa相符[25-26]。诱导菌体经超声裂解，纯化上清中的蛋白，结果显示VP3OVA171主要是包涵体形式，VP3OVA173主要是可溶性蛋白。

2.3 FMDV重组结构蛋白的共表达和VLPs组装

将质粒pSMA-VP3OVA173与pSMK-VP0/VP1共转入.BL21(DE)，用引物对VP3-F/R、VP0-F/R和VP1-F/R进行鉴定，结果显示扩增获得与预期大小909 bp、633 bp和684 bp相符的DNA片段，说明VP0、VP1和VP3OVA173基因成功共转入表达菌中。

诱导表达后用镍亲和树脂纯化蛋白，SDS-PAGE显示所纯化的蛋白与SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3OVA预期大小45 kDa、35 kDa和37 kDa相符。

用SUMO蛋白酶将SUMO-VP3OVA以及共表达的SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3OVA蛋白的SUMO切除以组装VLP，同时设未嵌入OVA的SUMO-VP3以及SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3共表达产物作为对照。结果显示，SUMO蛋白酶酶切后的蛋白与VP0、VP1、VP3和VP3OVA的预期大小33 kDa、23 kDa、24 kDa、和25 kDa相符。SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3切除SUMO标签后为VLPs，SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3OVA切除SUMO标签后为VLPOVA，保存备用。

2.4 重组蛋白的Western blotting分析

分别用猪抗FMDV血清和兔抗OVA抗体对嵌入OVA的SUMO-VP3OVA、共表达的SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3OVA以及切除SUMO后的VP0、VP1、VP3和VP3OVA进行Western blotting分析，同时设未嵌入OVA的SUMO-VP3以及SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3共表达蛋白作为对照。结果显示，嵌入OVA的SUMO-VP3OVA及共表达的蛋白以及切除SUMO后的VP0、VP1、VP3和VP3OVA均与未嵌入OVA的FMDV结构蛋白一样能够与猪抗FMDV血清反应(图1A–B)。兔抗OVA抗体仅与嵌入OVA的SUMO-VP3OVA和切除SUMO的VP3OVA反应(图1C)，说明OVA短肽正确嵌入到VP3中。

2.5 不同病毒样颗粒粒径测定和透射电镜检测

为了确定嵌入OVA短肽后的蛋白是否能够组装成VLPs，用动态光散射法和透射电镜检测透析组装后样品，结果显示，嵌入OVA样品的粒径比未嵌入的OVA样品的粒径稍大(图2A)，透射电镜显示，嵌入OVA的样品与未嵌入OVA的样品一样能够组装成VLPs (图2B)。

2.6 ELISA检测

用间接夹心ELISA法对VP3、VP3OVA、VLPs、和VLPOVA进行检测，同时设对照样品。如果OVA展示在VLPs表面，则可与OVA抗体反应，吸光值高，如果包裹于VLPs内部，则不能与OVA抗体反应，吸光值低。结果显示，VP3OVA和VLPOVA的吸光值比VP3和VLPs的均高，VP3OVA与VP3相比，差异显著，VLPOVA与VLPs相比，差异极显著，VLPOVA与OVA257-264对照相比差异极显著(图3)，表明OVA短肽嵌入VLPs，且位于VLPs表面。

图1 重组蛋白的Western blotting分析

图2 透析样品中DLS检测测定和电镜的观察

图3 ELISA法检测重组蛋白和VLPOVA中的OVA257-264

2.7 激光共聚显微镜鉴定OVA257-264

为了进一步确定OVA257-264肽正确嵌入VP3蛋白中，分别用培养基、VP3、VP3OVA173、VLPs和VLPOVA刺激培养第5天的BMDCs，培养24 h后，依次用猪血清、FITC标记的兔抗猪IgG抗体、APC抗鼠OVA257-264(SIINFEKL) 肽连接H-2Kb抗体孵育细胞。激光共聚焦显微镜对FMDV结构蛋白和OVA257-264肽进行定位，结果发现，仅在VP3OVA173蛋白和VLPOVA中绿色荧光的结构蛋白和红色荧光的OVA257-264肽发生共定位，而VP3蛋白和VLPs中只检测到绿色荧光的结构蛋白(图4)，证明短肽正确嵌入FMDV VP3，且随VP3蛋白酶切、组装到VLPOVA。

图4 激光共聚焦显微镜检测OVA257-264肽

3 讨论

本研究根据大肠杆菌表达特点，对短肽密码子进行优化，以减少该肽对蛋白表达的影响。结果显示，VP3的第173–174 aa嵌入OVA257-264并不影响蛋白的表达与VLPs的组装，而在第171–172 aa位点嵌入OVA257-264肽后，蛋白的可溶性表达量降低，主要以包涵体形式存在，这可能是外源肽嵌入该位点影响FMDV VP3衣壳蛋白折叠，这与陈冬冬等[25]构建了插入HA (第171–172位) 的基因组全长cDNA，但未能拯救到基因工程毒的研究结果一致。

FMD疫苗的免疫效力主要源于疫苗所引起的体液免疫反应，即B细胞表位诱导中和抗体的能力[28]。此外细胞免疫也很重要，但因T细胞不能识别完整天然抗原分子，故需抗原递呈细胞(如树突状细胞)的协助，将抗原由组织相容性复合物递呈到细胞表面。树突状细胞作为FMD疫苗免疫的重要靶细胞，其对调节机体免疫防御和诱发细胞免疫反应至关重要[29]。Yan等[30]研究发现，当短肽与OVA257-264连接时，可显著增强Clec9a+DC激活OVA特异性CD8+T细胞的能力，引起IFN-γ的高水平分泌和穿孔素、颗粒酶B mRNA的高表达。在B16-OVA肺转移小鼠模型中，WH-OVA257-264融合肽还可增强CD8+T细胞的活化。CD8+T细胞具有许多功能，包括识别和杀死受感染的细胞，产生促炎性细胞因子，用于辅助天然免疫细胞消除多种病原体[31]。Simerska等[32]研究证实，连接OVA的脂质核心肽(LCP) 可产生持久记忆CD8+T细胞应答，OVA257-264肽可增强抗原特异性CD8+T细胞增殖和IFN-γ产生。

本研究成功在FMDV VP3 (第173–174 aa) 中嵌入外源肽OVA257-264，VLPOVA的获得证明该位点外源肽的嵌入不影响蛋白的表达和组装，且OVA257-264肽位于VLPOVA的表面，有利于短肽被树突状细胞表面MHC Ⅰ类分子递呈给CD8+T细胞，从而有效激活CTL和辅助性T细胞，发挥细胞免疫应答。但其诱导树突状细胞的机制及是否有利于激活机体产生更强的免疫原性有待进一步试验验证。

[1] Alexandersen S, Zhang Z, Donaldson AI, et al. The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. J Comp Pathol, 2003, 129(1): 1–36.

[2] Doel TR, Chong WKT. Comparative immunogenicity of 146S, 75S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus. Arch Virol, 1982, 73(2): 185–191.

[3] Knight-Jones TJD, Robinson L, Charleston B, et al. Global foot-and-mouth disease research update and gap analysis: 2-epidemiology, wildlife and economics. Transbound Emerg Dis, 2016, 63 Suppl 1: 14–29.

[4] Robinson L, Knight-Jones TJ, Charleston B, et al. Global foot-and-mouth disease research update and gap analysis: 3-vaccines. Transbound Emerg Dis, 2016, 63(Suppl. 1): 30–41.

[5] Doel TR. FMD vaccines. Virus Res, 2003, 91(1): 81–99.

[6] Buonaguro L, Tornesello M L, Buonaguro FM. Virus-like particles as particulate vaccines. Curr HIV Res, 2010, 8(4): 299–309.

[7] Georgens C, Weyermann J, Zimmer A. Recombinant virus like particles as drug delivery system. Curr Pharm Biotechnol, 2005, 6(1): 49–55.

[8] Zhang LF, Zhou J, Chen S, et al. HPV6b virus like particles are potent immunogens without adjuvant in man. Vaccine, 2000, 18(11/12): 1051–1058.

[9] Belsham GJ, Abrams CC, King AMQ, et al. Myristoylation of foot-and-mouth disease virus capsid protein precursors is independent of other viral proteins and occurs in both mammalian and insect cells. J Gen Virol, 1991, 72(3): 747–751.

[10] Grubman MJG, Lewis SA, Morgan DO. Protection of swine against foot-and-mouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems. Vaccine, 1993, 11(8): 825–829.

[11] Terhuja M, Saravanan P, Tamilselvan RP. Comparative efficacy of virus like particle (VLP) vaccine of foot-and-mouth-disease virus (FMDV) type O adjuvanted with poly I:C or CpG in guinea pigs. Biologicals, 2015, 43(6): 437–443.

[12] Burgdorf S, Kautz A, Böhnert V, et al. Distinct pathways of antigen uptake and intracellular routing in CD4 and CD8 T cell activation. Science, 2007, 316(5824): 612–616.

[13] Platt CD, Ma JK, Chalouni C, et al. Mature dendritic cells use endocytic receptors to capture and present antigens. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(9): 4287–4292.

[14] Lipford GB, Hoffman M, Wagner H, et al. Primary in vivo responses to ovalbumin. Probing the predictive value of the Kb binding motif. J Immunol, 1993, 150(4): 1212–1222.

[15] Moffat JM, Cheong WS, Villadangos JA, et al. Hepatitis B virus-like particles access major histocompatibility class Ⅰ and Ⅱ antigen presentation pathways in primary dendritic cells. Vaccine, 2013, 31(18): 2310–2316.

[16] Grubman MJ, Baxt B. Foot-and-mouth disease. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(2): 465–493.

[17] Seago J, Jackson T, Doel C, et al. Characterization of epitope-tagged foot-and-mouth disease virus. J Gen Virol, 2012, 93(11): 2371–2381.

[18] Lawrence P, Pacheco JM, Uddowla S, et al. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) with a stable FLAG epitope in the VP1 G-H loop as a new tool for studying FMDV pathogenesis. Virology, 2013, 436(1): 150–161.

[19] Baranowski E, Ruiz-Jarabo CM, Lim F, et al. Foot-and-mouth disease virus lacking the VP1 G-H loop: the mutant spectrum uncovers interactions among antigenic sites for fitness gain. Virology, 2001, 288(2): 192–202.

[20] Wang HW, Xue M, Yang DC, et al. Insertion of type O-conserved neutralizing epitope into the foot-and-mouth disease virus type Asia1 VP1 G-H loop: effect on viral replication and neutralization phenotype. J Gen Virol, 2012, 93(7): 442–1448.

[21] Azuma H, Yoneda S. Structure and dynamics of the GH loop of the foot-and-mouth disease virus capsid. J Mol Graph Model, 2009, 28(3): 278–286.

[22] Curry S, Fry E, Blakemore W, et al. Dissecting the roles of VP0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus. J Virol, 1997, 71(12): 9743–9752.

[23] Chen DD, Bai XW, Gong XH, et al. Effect of amino acid mutation(s) in the G–H loop of VP3 on biological characteristics of foot-and-mouth disease virus serotype O. Acta Microbiol Sin, 2019, 59(7): 1285–1294 (in Chinese). 陈冬冬, 白兴文, 宫晓华, 等. VP3 G–H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响. 微生物学报, 2019, 59(7): 1285–1294.

[24] Bai XW, Bao HF, Li PH, et al. Engineering responses to amino acid substitutions in the VP0- and VP3-coding regions of panasia-1 strains of foot-and-mouth disease virus serotype O. J Virol, 2019, 93(7): e02278–18.

[25] Chen DD. Construction and comparative analysis of biological and immunoserological properties of site-directed mutants containing amino acid mutations in VP3 of foot-and-mouth disease virus[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2018 (in Chinese). 陈冬冬. 口蹄疫病毒VP3定点突变体的构建及其生物学特性和免疫血清学研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2018.

[26] Guo HC, Sun SQ, Jin Y, et al. Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system ininduce potent protective immune responses in guinea pigs, swine and cattle. Vet Res, 2013, 44: 48.

[27] Du P, Liu RH, Sun SQ, et al. Biomineralization improves the thermostability of foot-and-mouth disease virus-like particles and the protective immune response induced. Nanoscale, 2019, 11(47): 22748–22761.

[28] Bachrach HL, Moore DM, McKercher PD, et al. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus. J Immunol, 1975, 115(6): 1636–1641.

[29] Bayry J, Tough DF. Interaction of foot-and-mouth disease virus with dendritic cells. Trends Microbiol, 2006, 14(8): 346–347.

[30] Yan ZY, Wu YH, Du JF, et al. A novel peptide targeting Clec9a on dendritic cell for cancer immunotherapy. Oncotarget, 2016, 7(26): 40437–40450.

[31] Zhang N, Bevan MJ. CD8+T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity, 2011, 35(2): 161–168.

[32] Simerska P, Suksamran T, Ziora ZM, et al. Ovalbumin lipid core peptide vaccines and their CD4+and CD8+T cell responses. Vaccine, 2014, 32(37): 4743–4750.

Construction, expression and identification of chimeric foot-and-mouth disease virus-like particles

Ronghuan Liu, Huichen Guo, Ping Du, Hu Dong, Mengnan Guo, and Shiqi Sun

State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, OIE/National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China

To improve the specific recognition and presentation of virus-like particle (VLPs), and to develop immune-targeted VLPs vaccine, the gene fragment encoding OVA257-264peptide was inserted into the VP3 gene of foot-and-mouth disease virus (FMDV) between the 171th and 172th amino acids (aa) or 173th and 174th aa by reverse PCR. The recombinant proteins were expressed by usingand assembled into chimeric VLP (VLPOVA)after purification. The VLPOVAwas measured by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The recombinant protein and the assembled VLPs were evaluated by Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay and laser scanning confocal microscopy to confirm the insertion of OVA257-264peptide into VP3 and its location. The results show that insertion of OVA257-264into the 173thand 174thaa of FMDV VP3 did not affect the assembly of VLPs. The VLPOVAin size was larger than VLPs, and the OVA257-264peptide was located on the surface of VLPOVA.

foot-and-mouth disease virus, chimeric virus-like particles, OVA257-264, VP3

10.13345/j.cjb.190520

November 21, 2019;

April 21, 2020

Supported by: National Key Research and Development Program (Nos. 2017YFD0501100, 2017YFD0500900, 2016YFE0204100), National Natural Science Foundation of China (No. 31672592), Basic Scientific Research Operating Expenses for Central Scientific Research Institutes (Nos. 1610312016002, 1610312018003).

Shiqi Sun. Tel: +86-931-8312213; Fax: +86-931-8340977; E-mail:sunshiqi@caas.cn

国家重点研发计划 (Nos. 2017YFD0501100，2017YFD0500900，2016YFE0204100)，国家自然科学基金 (No. 31672592)，中央级科研院所基本科研业务费专项 (Nos. 1610312016002，1610312018003) 资助。

刘绒欢, 郭慧琛, 杜平, 等. 嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定. 生物工程学报, 2020, 36(7): 1305–1313.

Liu RH, Guo HC, Du P, et al. Construction, expression and identification of chimeric foot-and-mouth disease virus-like particles. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1305–1313.

(本文责编 郝丽芳)