叶黄素通过激活Nrf2信号传导通路抑制糖尿病性骨质疏松模型大鼠氧化应激及炎性反应的机制研究

张卫华，陈 东

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP)作为糖尿病引起的一种继发性骨质疏松，会出现不同程度的骨密度降低[1-2]。相关研究结果表明，1型糖尿病患者骨折的发生率是非糖尿病人群的6.3～6.9倍[3]，而骨折后的致残率及病死率极高，极大影响患者生活质量。叶黄素作为一种有效的抗氧化剂，能够有效缓解游离自由基对人体细胞及器官的过氧化损伤，现代药理研究发现其具有保护视觉、预防动脉硬化、抗氧化、抗癌等作用[4]。相关研究显示氧化应激及炎性反应在DOP发生进展中扮演着重要角色[5-6]。故本研究旨在通过建立糖尿病并卵巢切除骨质疏松模型，后用叶黄素进行干预，分析其对DOP的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雌性8周龄SD大鼠30只，体质量250～280 g，购于广东省医学实验动物中心[实验动物许可证号：SCXK(粤)2019-0035]，常规饲养、全天自由饮水，培育室温度20～25℃，湿度65%～70%，进行人工光照(昼夜各12 h)。

1.2主要试剂 链脲佐菌素(STZ)购自Solarbio公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；兔抗大鼠核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体购自上海谷研实业有限公司。

1.3实验动物分组及模型制备 30只雌性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、干预组各10只。模型组及干预组大鼠进行糖尿病造模前12 h禁食不禁饮，采取腹腔单次注射STZ 60 mg/kg，假手术组给予等体积柠檬酸缓冲液腹腔注射，注射后正常饮水饮食。注射72 h后检测大鼠空腹血糖，>16.7 mmol/L认为造模成功。将造模成功后的模型组及干预组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，保持仰卧位固定在手术台上，于腹部正中线切3 cm长的纵向切口，使皮肤切口偏向另一侧后，分离髂棘上1.5 cm处的肌肉，以眼科弯钳深入切口，找到一侧卵巢，用手术线结扎输卵管后切除并止血，采取同样方式切除另一侧卵巢，完成后间断缝合肌肉及皮肤，并在切口处滴青霉素抗炎。假手术组大鼠同样方式找到卵巢，切除卵巢附近小块脂肪，其余步骤一致。以股骨骨密度及血清雌二醇降低视为DOP造模成功[7]。

1.4药物干预 手术完成后1周，干预组大鼠给予200 mg/kg叶黄素灌胃干预，每日1次，假手术组及模型组大鼠给予等量0.9%氯化钠注射液每日1次灌胃。药物干预8周。

1.5样本采集 末次给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定在XR-36双能X线骨密度测量仪(亚光医用电子技术研究所生产)上，检测后肢股骨密度，取下腔静脉血1500 r/min离心15 min后，取上清存于-20℃条件下待测。断头处死大鼠，分离右侧股骨，一部分以10%甲醛固定并加入10%乙二胺四乙酸二钠脱钙后用于组织切片观察，另一部分于液氮中速冻转存至-80℃待测。

1.6股骨组织HE染色 取“1.5”中固定、脱钙后的股骨组织进行常规脱水、透蜡、包埋、切片后，苏木素伊红染色，中性树胶封片后显微镜下观察染色情况并拍照。利用BI 2000医学图像分析系统进行成骨细胞及破骨细胞计数。

1.7血清钙水平及炎症因子检测 取“1.5”中制备好的血清，采用全自动生化分析仪测定血清钙水平。应用酶标仪测定样本在450 nm处的吸光度(OD)值，并以固定浓度标准品为横坐标，相应OD值为纵坐标画出标准曲线，并根据检测样品测得的OD值计算相应的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8股骨组织中氧化应激指标检测 取“1.5”中分离的股骨在液氮环境下研磨成粉末状，称取50 mg样本加入450 μl磷酸缓冲盐溶液后混匀，根据酶联免疫吸附法试剂盒说明书操作步骤测定SOD、MDA、ROS水平，计算方式同“1.7”。

1.9Western blot法检测股骨组织中Nrf2、HO-1、NQO1水平 取“1.5”中分离的股骨在液氮环境下研磨成粉末状，称取50 mg样本加入450 μl磷酸缓冲盐溶液后混匀，经高速低温离心去沉淀，进行BCA蛋白定量、高温蛋白变性，通过Bradford法调整各组蛋白浓度一致。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗大鼠Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH抗体(1︰1000)一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1︰500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL发光液将PVDF膜显色，暗室曝光到X线片上，采用Imaging System软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参积分OD比值表示蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1叶黄素对各组大鼠病理变化的影响 HE染色结果显示：假手术组股骨组织中可见骨小梁排列整齐，间充质细胞数量较少，未见破骨细胞；模型组骨小梁排列紊乱，可见大量间充质细胞和红细胞，并且破骨细胞数量显著增加，成骨细胞数量显著减少；干预组有新生骨小梁形成，破骨数量显著减少，成骨细胞数量显著增多。见图1。

与假手术组相比，模型组骨密度、血清钙、成骨细胞数降低，而破骨细胞数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组与假手术组相比，骨密度、血清钙降低，破骨细胞数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，干预组骨密度、血清钙、成骨细胞数升高，而破骨细胞数降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同方法处理的SD大鼠骨密度、血清钙水平及成骨细胞、破骨细胞计数比较

2.2叶黄素对各组大鼠股骨组织中氧化应激指标的影响 与假手术组相比，模型组和干预组股骨组织中MDA含量及ROS荧光强度升高，SOD活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，干预组股骨组织中MDA含量及ROS荧光强度降低，SOD活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同方法处理的SD大鼠股骨组织SOD、MDA、ROS水平比较

2.3叶黄素对各组大鼠血清炎症因子水平的影响 与假手术组相比，模型组和干预组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(P<0.05)；与模型组相比，干预组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 不同方法处理的SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6比较

2.4叶黄素对各组大鼠股骨组织中Nrf2、HO-1、NQO1表达的影响 Western blot结果显示：与假手术组相比，模型组和干预组股骨组织中Nrf2、HO-1、NQO1表达水平降低(P<0.05)；与模型组相比，干预组股骨组织中Nrf2、HO-1、NQO1表达水平升高(P<0.05)。见图2及表4。

表4 不同方法处理的SD大鼠股骨组织Nrf2、HO-1、NQO1表达

3 讨论

随着人民生活水平的提高及老龄化程度的加重，糖尿病发病率呈逐年上升趋势，已成为肿瘤及心脑血管疾病后的第三大慢性非传染性疾病[8]。STZ是诱发糖尿病模型的常用药剂，相关研究发现，SD大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg 21 d后可显著观察到骨骺端碱性磷酸酶活性及钙离子含量降低[9]。本研究通过STZ注射和卵巢切除诱导DOP模型，结果显示大鼠骨密度、血清钙、成骨细胞数显著降低，而破骨细胞数显著升高，表明造模成功。

研究表明，氧化应激是DOP重要发病机制之一。正常生理情况下，机体内ROS的产生及清除会处于一种动态平衡，故破骨细胞产生的适量自由基能发挥促进骨组织改建作用[10]。胰岛素缺乏后会抑制抗氧化酶活性，清除ROS能力降低，破骨细胞产生的自由基产物无法清除，过量的氧自由基会产生一系列氧化损伤，抑制大部分细胞的分化、生长及增殖过程[11]。本研究显示，与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织中SOD活性显著降低，MDA含量及ROS荧光强度显著升高；与模型组相比，干预组股骨组织中MDA含量及ROS荧光强度降低，SOD活性升高。表明DOP大鼠体内氧化应激反应较为严重，而叶黄素干预后，SOD活性显著升高，MDA及ROS显著降低，可能是因叶黄素本身就是一种有效的自由基清除剂，能通过与ROS作用，降低ROS水平，减轻其对SOD活性的抑制作用，同时减少过量ROS对脂膜的攻击，从而降低MDA。Nrf2是一种重要的抗氧化蛋白，当机体产生氧化应激反应时，Nrf2能迅速磷酸化激活并转移至细胞核中，通过作用下游ARE蛋白，促进HO-1、SOD、NQO1等的表达[12]。HO-1作为Nrf2的下游靶蛋白具有多种作用，高表达HO-1可以显著减轻组织损伤[13]；NQO1则是一类黄素蛋白酶，通过催化胞内双电子还原反应，进而解除醌类物质对细胞的毒害，从而发挥细胞和器官保护作用[14]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织中Nrf2、HO-1、NQO1表达水平均显著降低，叶黄素干预后Nrf2、HO-1、NQO1表达水平均显著升高，表明叶黄素可能是通过激活Nrf2信号传导途径，诱导抗氧化蛋白表达，从而改善DOP大鼠的氧化应激反应来保护骨组织。

炎性反应也是DOP的重要发病机制，氧化应激反应发生的同时会促进TNF-α、IL-1β等促炎因子合成，同时也会激活NF-κB信号传导途径促进骨形成蛋白及IL-6等促炎因子表达，并利于破骨细胞增殖、分化及生长，加速骨吸收，促进DOP进展[15]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均显著升高，而叶黄素干预后TNF-α、IL-1β、IL-6均下降，可能原因为叶黄素改善了DOP大鼠体内炎性反应程度，降低自由基水平，减少了对炎性反应信号传导通路的刺激。

综上，叶黄素可能通过激活Nrf2信号传导通路，促进抗氧化酶合成分泌，减轻DOP大鼠的氧化应激反应及炎性反应程度，从而缓解骨质疏松。