miR-21介导PTEN/SMAD7信号传导通路调控糖尿病肾病大鼠肾纤维化作用研究

朱戈丽，伍 军，张艳霞，封宝红，毕智敏，巩雪敏，李 静

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病较严重的一种并发症，是慢性肾衰竭患者行血液透析或肾脏移植的首要因素[1]。DN典型的病理改变为肾小球、肾小管上皮细胞增大，细胞外基质增多，晚期进展为肾小球硬化[2]。但DN的具体发病机制尚未研究清楚，大部分学者认为与代谢紊乱、氧化应激、炎性反应等有关[3]。近年发现microRNA在个体发育、组织分化、细胞增殖与凋亡等多个过程中起重要的调控作用[4]。研究表明，多种microRNA在肾脏中均有表达，且与肾脏疾病的发生发展密切相关[5]。大量研究证实miR-21可能是DN的潜在分子靶点[6-7]。PTEN/SMAD7是miR-21下游重要的靶蛋白，但国内基于miR-21介导PTEN/SMAD7信号传导通路调控DN的相关研究较少，故本研究通过建立DN大鼠模型，分析miR-21介导PTEN/SMAD7信号传导通路在DN大鼠肾纤维化中的作用及其机制，为临床DN的诊断与防治提供依据。

1 材料与方法

1.1病例选取 收集2018年6月—2019年3月武汉市第三医院就诊的DN患者45例和体检健康者30例的血清样本，纳入标准：DN患者符合DN诊断标准[8]；体检健康者各项实验室生化指标均正常；年龄>18岁。排除标准：合并心、脑血管疾病；合并糖尿病酮症酸中毒者；合并恶性肿瘤、自身免疫功能障碍等慢性疾病者；存在影响血miR-21水平因素者。DN患者中男26例，女19例；年龄53～76(62.39±9.85)岁。体检健康者中男18例，女12例；年龄55～78(63.72±8.79)岁。

1.2实验动物 实验动物为浙江中医药大学动物实验研究中心提供[动物许可证号：SCXK(浙)2019-0004]的雄性SPF级SD大鼠48只，6～8周龄，体质量180～220 g，适应性喂养1周后用于实验。

1.3试剂与仪器 高糖高脂饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司，链脲佐菌素(STZ)购自上海源叶生物科技有限公司，慢病毒载体、miR-21慢病毒、引物序列购自北京华夏远洋科技有限公司，miRNA逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia公司，SYBR Green qPCR Master Mix购自德国Merck millipore公司，BCA试剂盒购自美国Sigma公司，蛋白一抗购自美国Abcam公司。逆转录定量聚合酶链式反应仪购自美国Thermo Fisher公司，全自动生化分析仪购自中翰盛泰生物技术股份有限公司。

1.4研究方法

1.4.1动物分组、建模及处理：48只雄性SD大鼠随机分为空白对照组(Blank组)、DN组、空载慢病毒组(Empty vector组)和沉默miR-21组(miR-21-shRNA组)，每组12只。Blank组给予正常饲料，其他组大鼠给予高糖高脂饲料喂养6周后，尾静脉注射30 mg/kg STZ构建DN大鼠模型，72 h后检测大鼠血糖，若血糖≥16.7 mmol/L提示DN动物模型构建成功[9]，均造模成功。造模成功后第1、5、9周Empty vector组和miR-21-shRNA组分别尾静脉注射空载慢病毒液和miR-21慢病毒液，感染复数均为100；Blank组和DN组以等量0.9%氯化钠注射液替代。于建模成功后第12周采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，收集大鼠尾动脉血液3 ml和双侧肾脏组织。

1.4.2实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测DN患者和体检健康者血清和大鼠肾组织中miR-21的表达：血液样本进行抗凝处理后，小心分离淋巴细胞，加入TRIzol裂解液；取各组大鼠适量肾脏组织，加入TRIzol裂解液，以氯仿-异丙醇体系提取样品总RNA，经微量核酸仪检测其纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；参照miRNA逆转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA模板；混入SYBR Green qPCR Master Mix进行qRT-PCR检测。miR-21的上游引物为5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物为5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；内参基因U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。参数设置：95℃ 30 s，95℃ 10 s,60℃ 34 s，72℃ 1 min，共40个循环。采用2-△△CT法计算样品中miR-21相对表达量。

1.4.3肾功能指标检测：将大鼠血液以2000 r/min离心10 min，分离上层血清，应用全自动生化分析仪检测大鼠血清肌酐(SCr)、尿素(BUN)含量。

1.4.4肾组织病理变化观察：将各组大鼠肾脏组织制成石蜡组织切片行常规HE染色和Masson染色，光镜下观察肾脏病理组织变化和纤维化程度。

1.4.5Western blot法检测大鼠肾组织中相关蛋白的表达：采用放射免疫沉淀分析裂解液提取肾组织粉末中总蛋白，经BCA试剂盒测定蛋白浓度；取适量蛋白样品，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜上；再浸于5%脱脂奶粉中封闭，37℃下孵育1 h；加入I型胶原(Col I)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)及SMAD7蛋白一抗，4℃下孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育30 min；经化学发光后观察蛋白条带，利用Image J软件进行灰度分析，以β-actin为内参，计算Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN及SMAD7蛋白相对表达量。

2 结果

2.1DN患者和体检健康者血清miR-21水平比较 体检健康者血清中miR-21表达量为1.06±0.13，DN患者miR-21表达量为2.67±0.32，DN患者血清miR-21水平明显高于体检健康者(t=26.111，P<0.001)。见图1。

图1 DN患者和体检健康者血清miR-21水平比较 DN为糖尿病肾病；与健康者比较，bP<0.01

2.2沉默miR-21对各组大鼠肾组织中miR-21水平影响 与Blank组比较，DN组、Empty vector组及miR-21-shRNA组肾组织中miR-21水平明显升高(P<0.01)；与DN组比较，miR-21-shRNA组miR-21水平明显降低(P<0.01)，但Empty vector组miR-21水平无明显变化(P>0.05)；与Empty vector组比较，miR-21-shRNA组miR-21水平明显降低(P<0.01)，见表1。

表1 沉默miR-21对各组大鼠肾组织miR-21的影响

2.3沉默miR-21对各组大鼠肾功能指标的影响 与Blank组相比，DN组、Empty vector组及miR-21-shRNA组SCr水平明显升高(P<0.05)，DN组和Empty vector组BUN水平明显升高(P<0.01)；与DN组相比，miR-21-shRNA组SCr、BUN水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，但Empty vector组上述指标水平无明显改变(P>0.05)；与Empty vector组比较，miR-21-shRNA组SCr、BUN水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 沉默miR-21对各组大鼠肾功能指标的影响

2.4沉默miR-21对各组大鼠肾组织病理变化的影响 HE染色显示，Blank组肾组织中肾小球、间质结构正常，系膜细胞数量和基质分布无明显改变；DN组肾小球明显增大，系膜细胞增殖明显，间质增多，肾小管上皮细胞伴有坏死、萎缩；与DN组比较，miR-21-shRNA组上述病理改变明显减轻，但Empty vector组与DN组无明显差异。Masson染色显示，Blank组肾小球、肾小管及间质结构均发生异常变化；DN组肾小球基质中胶原纤维显著增加，纤维组织增多；与DN组相比，miR-21-shRNA组纤维化程度减轻，但Empty vector组无明显变化。见图2。

图2 沉默miR-21对各组大鼠肾组织病理变化的影响(×400) Blank组为空白对照组，DN组为糖尿病肾病组，Empty vector组为空载慢病毒组，miR-21-shRNA组为沉默miR-21组

2.5沉默miR-21对各组大鼠肾组织中相关蛋白表达的影响 与Blank组相比，DN组、Empty vector组及miR-21-shRNA组肾组织中Col I、MMP-2及TGF-β1表达明显上调(P<0.01)，PTEN和SMAD7表达明显下调(P<0.01)；与DN组相比，miR-21-shRNA组Col I、MMP-2及TGF-β1表达明显下调(P<0.01)，PTEN和SMAD7表达明显上调(P<0.01)，但Empty vector组Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN和SMAD7表达无明显变化(P>0.05)；与Empty vector组比较，miR-21-shRNA组Col I、MMP-2及TGF-β1表达明显下调(P<0.05)，PTEN和SMAD7表达明显上调(P<0.05)，见表3。

表3 沉默miR-21对各组大鼠肾组织中相关蛋白表达的影响

3 讨论

miRNA是体内高度保守、非编码的小RNA分子，广泛分布于各种组织和细胞中，但存在差异性表达[10]。数据表明，miRNA在DN中发挥着重要的调节作用[11]。本研究采用qRT-PCR检测DN患者和体检健康者血清中miR-21的表达，结果显示miR-21在DN患者中的表达明显高于体检健康者，提示miR-21可能参与DN的发病过程，与McClelland等[12]研究结果一致。但miR-21在DN中的具体作用机制还需进一步研究。

近年来，miR-21调控作用研究已在各领域中展开。肿瘤方面研究发现，miR-21是一种潜在的促癌基因，与肾癌、胃癌、肺癌等多种癌症密切相关，且相关机制研究较多[13]。心血管系统方面研究发现，miR-21可能通过调控血管内皮细胞功能，参与心血管疾病的发生发展[14]。Wang等[15]研究显示，miR-21在DN中过表达，可介导TGF-β1加剧肾损伤。本研究通过高糖高脂饲料结合STZ诱导DN大鼠模型，验证了miR-21在DN中的作用。同时，抑制miR-21的表达可显著改善DN大鼠肾组织病理损伤，降低血清SCr、BUN水平，进一步说明miR-21可能参与了DN的发展过程。

Bao等[16]研究显示，miR-21通过作用于下游靶基因，来减少细胞外基质降解、促进肾脏间质肥大和系膜基质沉积，加剧肾脏组织纤维化，但国内尚缺乏相关报道。PTEN基因是蛋白激酶(AKT)的负性调节器，通过将磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的第3位脱磷酸转变为4,5-二磷酸磷脂酰肌醇，从而抑制AKT活性，阻断PI3K/AKT信号传导通路，而参与多种生命活动过程。Sekar等[17]观察到OVE26 Ⅰ型糖尿病小鼠的系膜细胞中miR-21异常高表达，随着病程的迁延，其肾脏组织中miR-21表达也逐渐升高；同时，高表达的miR-21会抑制PTEN的表达，敲低miR-21表达后PTEN表达增加，说明高血糖可引起肾脏组织中miR-21表达的增加，抑制 PTEN 蛋白表达可加剧肾纤维化。另外，细胞外基质沉积也是DN重要的病理表现之一。Lin等[18]研究发现，miR-21可能经介导SMAD7调节肾损伤，敲除miR-21恢复肾组织中SMAD7水平，并抑制TGF-β1和核转录因子活化，从而改善肾纤维化程度。本研究显示，DN大鼠肾组织出现明显的纤维化，且Col I、MMP-2及TGF-β1的表达明显上调，PTEN和SMAD7的表达明显下调；而沉默miR-21后，肾纤维化程度降低，Col I、MMP-2及TGF-β1的表达显著下调，PTEN和SMAD7的表达明显上调，提示miR-21可能通过抑制PTEN/SMAD7信号传导通路，上调纤维化相关蛋白的表达，促进细胞外基质的沉积，引起DN大鼠肾纤维化，与上述研究结果相符。

综上所述，干扰miR-21的表达可作为治疗DN的潜在策略，其可能通过PTEN/SMAD7信号传导通路逆转肾组织纤维化，但DN不同阶段与miR-21的关系还需大量临床研究验证。