中华鳖弗氏柠檬酸杆菌的鉴定及病理组织观察

黄莉萍，安莉丽，李 芳，杨成年，李 虹，吕光俊，向 枭，孙翰昌，翟旭亮，*，朱成科，*

(1.西南大学 动物科学学院，重庆 402460； 2.重庆市水产技术推广总站，重庆 400020； 3.重庆文理学院 林学与生命科学学院，重庆 402160)

中华鳖(Pelodiscussinensis)，俗名团鱼、甲鱼，隶属脊索动物门、爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属，主要分布于我国的长江、黄河流域和华南地区[1]。中华鳖肉味鲜美，营养丰富，具有高蛋白低脂肪的特点，深受广大消费者喜爱[2]。据2018《中国渔业统计年鉴》，全国鳖的养殖总产量达32.2万t[3]，市场需求旺盛。近年来，主要养殖方式有温室养殖、两段式养殖、纯外塘养殖[4]和仿生态养殖，其中仿生态养殖中华鳖外观良好、体质健壮、活动力强、鲜味氨基酸含量丰富、口感较好，且经济效益明显优于前几种养殖模式[5]。但由于仿生态养殖的生长周期较长，易受环境影响，养殖条件难以控制[6]，易暴发各类病害，尤其是细菌性疾病，如已报道的红脖子病、红底板病、白底板病、穿孔病、腐皮病等[7]，给仿生态养殖业带来了极大的经济损失。

2018年5月，重庆市永川区某仿生态养殖场出现中华鳖大量死亡现象，主要症状表现为病鳖四肢软弱无力，反应迟钝；病鳖体表泛红，底板有出血性红斑；腮腺充血发炎，肠道糜烂性出血，患病率较高，死亡率达70%以上。为查明病因，本研究以症状明显的濒死中华鳖为材料，对其进行病原菌分离鉴定和病理组织切片观察，以期为该病的临床防治和诊断提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鳖

患病中华鳖于2018年5月采自重庆市永川区某仿生态鳖养殖场，体质量约(1 500±100)g，具有明显的患病症状。健康中华鳖购自重庆市荣昌区某养殖场，组织切片对照试验鳖体质量(1 000±100)g，共3只；人工感染试验的鳖体长(10±2)mm，体质量(30±5)g，共180只，观察一周确认健康无异常后用于感染试验。

1.1.2 试验主要试剂与仪器

试剂：普通营养琼脂培养基(TaKaRa公司)、PCR反应体系(TaKaRa公司)、pMD-19T(TaKaRa公司)、大肠埃希菌感受态细胞DH5α，药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)。仪器：恒温摇床(江苏省金坛市盛威实验仪器厂)、生化培养箱(宁波新芝生物科技股份有限公司)、PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、切片机(德国莱卡RM2235)、光学显微镜(奥林巴斯BX51TF)等。

1.2 病原菌分离及纯化

选择具有典型患病症状的濒死中华鳖于超净工作台中，75%乙醇擦拭病鳖体表进行消毒。解剖后用接种环蘸取患病鳖各脏器组织于普通琼脂培养基上划线，28 ℃培养24 h，观察并选取其中的优势单菌落进行重复划线纯化，4 ℃保存待用。

1.3 人工感染试验

将分离菌株划线接种于普通琼脂培养基上，28 ℃培养24 h后，用0.65%的生理盐水洗脱并离心收集菌体，参照麦氏比浊法调整菌液浓度，健康鳖分成4组试验组和对照组，每组30只，试验组分别用浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105CFU·mL-1的菌悬液注射感染[8]。注射方式为腿部肌肉注射，每只鳖注射菌液0.1 mL，对照组每只注射0.1 mL 0.65%的生理盐水。水温28～30 ℃，每天正常通气换水，投喂深圳新光饲料有限公司的中华鳖配合饲料，日投饵率为3%，观察接种后鳖的活动情况并记录其发病与死亡情况。对人工感染后具有自然病状的濒死中华鳖再次进行病原菌分离鉴定。

1.4 病原菌生理生化鉴定

参照ATB系统细菌自动检定仪(法国Bio-merieux公司)、API 20E试剂盒使用说明进行鉴定，鉴定结果参考文献[9]和[10]的标准判断细菌种类。

1.5 16S rRNA和gyrB序列的扩增及系统发育分析

采用煮沸法提取病原菌总DNA[11]。16S rRNA基因扩增采用通用引物F-16S/R-16S，F-16S：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R-16S：5′-TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3′[12]；gyrB基因扩增采用通用引物F-gyrB/R-gyrB，F-gyrB：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′；R-gyrB：5′-GACGAGTACAACCCGGACAA-3′[13]。PCR用50 μL反应体系：10×PCR Buffer(含Mg2+)5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，rTaq酶(5 U·μL-1)0.4 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，ddH2O 39.6 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，16S rRNA基因72 ℃延伸50 s，31个循环，gyrB基因30个循环；最后72 ℃终延伸10 min[14]。1%琼脂糖凝胶电泳检测。用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物回收纯化，pMD-19T载体连接，转化进DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送华大基因公司测序。

1.6 组织病理观察

取自然患病濒死中华鳖和健康中华鳖的肝脏、脾脏、肾脏、胰脏和前肠组织，用10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，苏木精—伊红(HE)染色，中性树脂胶封片，置于光学显微镜下观察[15]。

1.7 药敏试验

药敏试验参考美国临床实验室标准化委员会(National Committee For Clinical Laboratory Standards，NCCLS)抗微生物药物敏感性试验执行标准K-B法进行[16]。将分离纯化的菌株挑入普通液体培养基中，28 ℃振荡培养3 h后，将菌液均匀涂布于固体培养基上，等距贴上药敏纸片[17]。28 ℃培养24 h，依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的抗菌药物敏感性试验标准，判定病原菌对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 自然发病情况

患病中华鳖主要表现为：长时间停留在水面，伸长脖子，四肢无力，反应迟钝，极易捕捉；病鳖体表泛红，背板有大量淤泥沉积，底板有出血性红斑；患病死亡的鳖头颈肿胀发软、口鼻出血、四肢伸开、生殖器外突。解剖患病濒死中华鳖发现腮腺出血糜烂，有纤毛状凸起，呈溃疡性病灶；咽喉部糜烂出血严重；有大量腹水；肝脏肿胀充血；肠道弹性降低，内壁红肿、充血，呈糜烂状(图1)。

2.2 致病菌的分离与形态学观察

仅从濒死病鳖肠道分离得到一株优势菌，命名为PS01。菌株PS01在28 ℃普通固体培养基上培养24 h，形成直径1.0～1.5 mm的圆形菌落，经革兰氏染色呈阴性，细菌形态为短杆菌，两端钝圆或平直，多数单个排列，大小为3～6 μm，见图2。

2.3 人工感染试验

对健康鳖进行腿部肌肉注射分离菌株，感染结果见表1。结果显示，对照组中华鳖在7 d内无异常。1.0×108CFU·mL-1试验组中华鳖2 d内全部死亡；1.0×107CFU·mL-1试验组中华鳖7 d内死亡率为73.3%；1.0×106CFU·mL-1试验组中华鳖7 d内死亡率为26.7%；1.0×105CFU·mL-1试验组中华鳖7 d内死亡率为6.7%；根据孙氏寇氏改良法[18]得到分离菌株对30 g左右的中华鳖半数致死浓度为9.3×104CFU·g-1。人工感染的中华鳖四肢无力，体表泛红，底板有出血性红斑，解剖发现大量腹水同时肠道出血，腮腺轻度发炎，其症状与自然发病症状基本一致。

表1 人工感染实验结果

2.4 病原菌生理生化鉴定

菌株PS01能运动，不能产生H2S；MR试验和和七叶灵水解阳性，VP试验阴性；赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶阴性；能利用D-甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖和半乳糖，不能利用D-葡萄糖、肌醇、卫矛醇、棉籽糖、木糖，其生理生化特性见表2。经ATB Expression生化自动鉴定仪(IS32 STREP)软件的分析结果，结合文献[9]和[10]的标准判断细菌种类可初步判定分离菌株PS01为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)。

表2 PS01菌株的生化鉴定结果

A，患病中华鳖底板；B，患病中华鳖腮腺; C，患病中华鳖肠道。A，Shell of diseased P. sinensis; B，Parotid gland of diseased P. sinensis; C，Intestine of diseased P. sinensis.图1 患病中华鳖临床特征Fig.1 Clinical characteristics of diseased P. sinensis

A，PS01普通营养培养基生长的菌落形态；B，分离菌革兰染色观察(1 000×)。A，Colony morphology of PS01 common nutrient medium; B，Observation on Gram staining of isolated bacteria (1 000×).图2 致病菌形态及革兰氏染色Fig.2 Morphology of pathogenic bacteria and Gram straining

2.5 16S rRNA和gyrB序列分析及系统发育树的构建

以PS01的菌液DNA为模板，分别用16S rRNA和gyrB基因的通用引物进行PCR扩增，预期可得到长度大约为1 500和1 200 bp的条带，见图3，与预期结果相一致。对目的条带进行割胶回收、纯化、与pMD-19T vector载体连接、转化E.coliDH5α感受态细胞、挑选阳性克隆测序，发现菌株PS01所获得的16S rRNA和gyrB基因部分序列片段大小分别为1 494和1 087 bp。

菌株PS01 16S rRNA基因与GenBank上登录的弗氏柠檬酸杆菌(登录号：KY352232)的相似性高达99.7%。菌株PS01gyrB基因与GenBank上登录的弗氏柠檬酸杆菌(登录号：JX001436)的相似性高达98.7%。分别以菌株PS01的16S rRNA和gyrB基因与GenBank中已登录的其他柠檬酸杆菌属进行比对，并以迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)为外类群，用MEGA 5.0软件建立系统发育树。结果显示，菌株PS01均与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支，且支持率均高达99%，如图4、图5，可判定菌株PS01为弗氏柠檬酸杆菌。

图5 菌株PS01 gyrB基因系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequences

图4 菌株PS01 16S rRNA基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

M，DL2000 DNA marker；1，16S rRNA；2，gyrB；3，阴性对照。M，DL2000 DNA marker; 1，16S rRNA; 2，gyrB; 3，Negative control.图3 病原菌株PS01的16S rRNA和gyrB基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA and gyrB gene in strain PS01

2.6 病理切片观察

患病中华鳖主要受损器官为肝脏、脾脏、肾脏、胰脏和肠道。观察比较健康中华鳖与患病中华鳖的受损器官病理组织切片差异。

健康鳖的肝细胞呈多角形，以中央静脉为中心，放射状排列形成肝索。肝索互相吻合成网状，网眼内为血液流经的地方，是肝小叶内的毛细血管，称为肝血窦(图6-A)。患病鳖肝脏类纤维化变性，毛细血管破裂，肝血窦淤血严重，苏木精-伊红(HE)染色下深红色的条状肝血窦与淡红色的变性坏死肝细胞相间存在。肝组织基本结构模糊，表现严重血肿，肝细胞彼此之间界限不明，胞体肿涨，呈颗粒变性，更严重的则为空泡变性，胞内有大小不等的空泡，胞核肿大，空泡化(图6-a)。

健康鳖脾实质由红髓、白髓和边缘区三部分组成，红髓与白髓区分明显，实质细胞丰富，正常，组织内还有椭圆体和零散的黑色素巨噬细胞，椭圆体外围鞘室内含有红细胞及巨噬细胞(图6-B)。患病鳖脾脏椭圆体消失，红髓、白髓区分不明显，红细胞与淋巴细胞混合分布，黑色素巨噬细胞有增多趋势(图6-b)。

健康鳖肾脏颜色鲜红，肾血管球、肾小囊腔体积正常。肾实质包括皮质和髓质，肾皮质包括肾小体、近曲小管、远曲小管等结构(图6-C)。正常鳖肾小管之间间隙明显，而患病鳖肾小管上皮细胞肿胀，使管间间隙变小，几乎消失，HE染色变浅。部分肾小球萎缩，肾小囊腔相对增大(图6-c)。

健康鳖胰腺表面的被膜由外层的致密结缔组织和内层的疏松结缔组织构成，疏松结缔组织深入胰实质内，将实质分隔成很多小叶，小叶间结缔组织少，使小叶分隔并不明显，其内有小叶间导管(图6-D)。患病鳖胰腺组织之间间隙增大，空白区域增多趋势明显，有轻度肿胀。胰腺细胞胞核肿大，部分呈空泡状，HE染色变浅(图6-d)。

A，健康中华鳖肝；B，健康中华鳖脾；C，健康中华鳖肾；D，健康中华鳖胰；E、F，健康中华鳖肠；a，患病中华鳖肝；b，患病中华鳖脾；c，患病中华鳖肾；d，患病中华鳖胰；e、f，患病中华鳖肠。H，肝细胞；HS，肝血窦；L，淋巴细胞；E，椭圆体；M，黑色素细胞；RBC，红细胞；WP，白髓；RP，红髓；DT，远曲小管；TG，肾小管间隙；PT，近曲小管；PC，泡心细胞；Pg，胰腺组织间隙；S，浆膜；EC，上皮细胞；GC，杯状细胞。A，Liver of healthy P. sinensis; B，Spleen of healthy P. sinensis; C，Kidney of healthy P. sinensis; D，Pancreas of healthy P. sinensis; E，F，Intestinal of healthy P. sinensis; a，Liver of diseased P. sinensis; b，Spleen of diseased P. sinensis; c，Kidney of diseased P. sinensis; d，Pancreas of diseased P. sinensis; e，f，Intestinal of diseased P. sinensis. H，Hepatocyte; HS，Hepatic sinusoid; L，Lymphocyte; E，Ellipsoid; M，Melancyte; RBC，Erythrocyte; WP，White pulp; RP，Red pulp; DT，Distal convoluted tubule; TG，Tubular gap; PT，Proximal convoluted tubule; PC，Pancreatic cells; Pg，Pancreatic gap; S，Serosa; EC，Epithelial cell; GC，Goblet cell.图6 健康中华鳖和患病中华鳖内脏病理组织学特征Fig.6 Pathological and histological features of viscus in healthy P. sinensis and sick P. sinensis

健康鳖肠壁分为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜。由黏膜的上皮细胞和固有膜共同形成许多肠绒毛，黏膜下层由结缔组织构成，深入上皮形成褶皱。肌层由内环外纵两层平滑肌构成，肌间有结缔组织和神经丛。外膜为浆膜，由单层扁平细胞构成(图6-E、F)。患病鳖前肠固有层的毛细血管扩张充血，黏膜下层和肌层的毛细血管有不同程度扩张充血，浆膜脱落，黏膜层溃烂严重，肠壁结构被破坏，肠腔内有大量由脱落的肠黏膜碎片和因毛细血管破裂溢入管腔的红细胞及其碎片。肠绒毛绝大部分坏死脱落，仅存的一些结构也不完整，毛细血管破裂，红细胞大量溢出，HE染色变深。固有层充血严重，杯状细胞、上皮细胞大部分坏死凋亡(图6-e、f)。

2.7 药敏特性

本实验检测了菌株PS01对氟苯尼考等39种抗生素的抗性(表3)。其中包括麦迪霉素等三种大环内酯类，头孢哌酮等9种β-内酰胺类，多西四环素等3种四环素，呋喃妥因等2种硝基呋喃类，复方新诺明等2种磺胺类，阿米卡星等6种氨基糖苷类，恩诺沙星等5种喹诺酮类，氟苯尼考等两种氯霉素类以及林可霉素，多黏霉素等6种其他类抗生素。结果表明，分离菌株对多西环素等18种抗菌药高度敏感，对氟苯尼考等3种抗菌药中度敏感，对复方新诺明等18种抗菌药表现为耐药。

表3 PS01菌株药敏试验结果

3 讨论

本研究从患病中华鳖肠道中分离得到一株致病菌PS01，人工回归感染试验结果符合科赫法则，确定菌株PS01为中华鳖的致病菌。经生理生化鉴定初步判定菌株PS01为弗氏柠檬酸杆菌，为进一步确定其准确的分类地位，本研究进行了16S rRNA和gyrB基因序列分析。16S rRNA基因分子量大小适中便于序列分析，但是其对同属近缘种的分辨率不足。而gyrB基因较16S rRNA具有更高的替换率，适合亲缘关系较近的物种区别与鉴定[19]。因此，为了更准确地确定分离菌株的分类，本研究进行了gyrB基因序列分析。结合形态学、生理生化特性以及16S rRNA和gyrB序列分析，综合判定分离菌株PS01为弗氏柠檬酸杆菌，鉴定结果准确、科学、严谨。

弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)隶属于变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属，且为柠檬酸杆菌属的模式种。弗氏柠檬酸杆菌的致病性报道最先出现在鱼类，已报道弗氏柠檬酸杆菌对罗非鱼(Oreochromsmossambcus)[20-21]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[22]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[19]、花鳗鲡(Anguillamarmorata)[23]、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)[24]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[25-26]等水生动物有较强的致病性。近年来，在竹鼠(Rhizomyssinensis)[13]、小鼠(Musmusculus)[22]、牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)[27]中都相继发现感染弗氏柠檬酸杆菌的患病实例，且该菌有毒力增强、耐药性显著的趋势。结合孙氏寇氏改良法确定分离菌株PS01对中华鳖的LD50为：9.3×104CFU·g-1，其致病性较高，能够引起动物的大量死亡，与文献[28-29]的报道相一致。已有报道弗氏柠檬酸感染中华鳖[30-32]，感染症状与本研究中描述的基本一致，但内脏病变更加严重。组织学检查发现，中华鳖肝脏、脾脏、肾脏、胰脏和前肠组织都有明显病变。肝脏的病变情况与中华鳖非寄生性肝病的报道[33]症状相似，肝脏因细胞变性和肿胀，挤压内脏器官，出现血肿症状，继续恶化则可发展为肝硬化、肝性水肿。脾脏、肾脏和胰脏病变情况与已报道的其他细菌感染中华鳖[34-35]的症状存在差异，本研究未见细胞坏死脱落，但初期症状相似，基本都有细胞空泡变性等。肠道病变最为严重，浆膜脱落，黏膜层严重溃烂，肠绒毛绝大部分坏死脱落。病原从中华鳖的肠道中分离，同时肠道也是感染最为严重的组织，可以推测肠道是该菌的主要靶器官。弗氏柠檬酸杆菌主要引起动物的肠道感染，但是近年来，临床上发现毒力较强的菌株可以穿过肠黏膜，进而在全身扩散传播，引起机体系统感染[27]，这可能是造成肝脏、脾脏等器官同时病变的原因之一。此外，春季随着水温升高，肠道内的病原菌开始大量繁殖，分泌产生溶血性、肠毒性和细胞毒性的外毒素，也可进人肠道微血管，随血液循环到全身各内脏组织，使各内脏发生变性、坏死和发炎。

药敏试验结果表明，分离菌株对多西环素、四环素、恩诺沙星等18种抗菌药高度敏感，对先锋霉素、氟苯尼考、新霉素3种抗菌药中度敏感。对杆菌肽、吡哌酸、复方新诺明等18种抗菌药表现为耐药。与花鳗鲡[27]体内分离得到的菌株抗药性存在部分差异，可能是由于菌株来源、地理环境以及用药情况等不同造成的。因此，在养殖过程中应结合无公害食品渔用药物使用准则(NY 5071—2002)，有针对性地严谨选择敏感性药物，避免病原菌产生抗药性。