孤儿核受体Nur77/NR4A1调节巨噬细胞炎症反应研究进展

蒋玉洁 罗维贵 廖品琥

[专家介绍]廖品琥，教授、主任医师，英国帝国理工大学医学博士，博士生导师，广西医学会会长，广西医师协会副会长，中国医院管理学会常務理事，广西医学会重症医学分会副主任委员，暨南大学临床医学专业学位教育指导委员会委员，现任广西壮族自治区卫生健康委员会党组书记、主任。曾在英国帝国理工大学皇家布朗普顿医院（Royal Brompton Hospital）从事博士后研究。研究方向为急危重症分子免疫机制。任多家医学杂志的主编、副主编及编委，主持国家自然科学基金4项、广西科技厅攻关项目2项，广西教育厅、广西卫生厅重点科研项目各1项。医学论文《Ventilatorassociated lung injury》发表于国际著名期刊《Lancet》，学术观点被欧美学者广泛引用。共发表学术论文100余篇，其中SCI收录23篇，出版专著及教材8部，曾获广西科技进步二、三等奖，广西“十百千人才工程”第二层次人选。

【摘要】巨噬细胞作为抵御病原体入侵的第一道防线，在固有免疫和适应性免疫中均发挥不可或缺的作用。孤儿核受体是一类目前尚未发现天然配体的核受体，Nur77/NR4A1是其NR4A亚家族中的成员之一，广泛表达于各组织、器官，通过转录及非转录调节作用，参与细胞炎症反应、增殖、分化、凋亡、自噬、代谢等过程。近期研究发现，Nur77/NR4A1参与巨噬细胞多种功能的调控。对Nur77/NR4A1在巨噬细胞炎症反应中的作用及机制进行综述，有助于更好地了解巨噬细胞相关炎症性疾病的分子机制。

【关键词】孤儿核受体;Nur77;NR4A1;巨噬细胞;炎症反应

中图分类号：R363文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.06.001

【Abstract】  As the first line of defense fighting against pathogen invasion，macrophages play an indispensable role in innate and adaptive immunity.Orphan nuclear receptor is a kind of nuclear receptor whose natural ligand has not been found yet.Nur77/NR4A1 is a member of NR4A subfamily，which is widely expressed in various tissues and organs.Through transcriptional and non transcriptional regulation，Nur77/NR4A1 participates in the process of cell inflammation，proliferation，differentiation，apoptosis，autophagy，metabolism，etc.Recent studies revealed that Nur77/NR4A1 involves in the regulation of multiple functions of macrophages.Herein，we review the role of Nur77/NR4A1 in macrophagemediated inflammation，which is helpful to achieve a better understanding of the cellular and molecular mechanisms of macrophagemediated inflammatory diseases.

【Key words】orphan nuclear receptor;Nur77;NR4A1; macrophage;inflammatory response

有关巨噬细胞的研究虽然已跨越百年，但其在维持内环境稳定和疾病中的作用仍未完全阐明[1]。巨噬细胞作为对抗病原体入侵的第一道防线，是机体免疫系统中必不可少的组成部分。然而，在一些急慢性炎症性疾病中，巨噬细胞炎症反应持续时间过长或反应过度将导致局部内环境失稳态，加重组织损伤。因此，抑制过度的巨噬细胞炎症反应或可成为巨噬细胞介导的急慢性炎症性疾病的治疗新靶标[2]。孤儿核受体是一类目前尚未发现天然配体的核受体，Nur77/NR4A1是其NR4A亚家族中的成员之一，广泛表达于各组织、器官，通过转录及非转录调节作用，参与细胞炎症反应、增殖、分化、凋亡、自噬、代谢等过程。核受体亚家族4 A组（Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A，NR4A）包括成员1（Nur77/NR4A1）、成员2（Nurr1/NR4A2）及成员3（Nor1/NR4A3）。Nur77/NR4A1作为核因子，既可是转录激活因子，亦可是转录抑制因子，这取决于其招募的共调节因子和翻译后修饰[3]。除了通过转录调节作用于靶基因之外，Nur77还可通过与线粒体结合等非转录调节作用参与多种生物学过程[4]。Nur77/NR4A1可在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNFα）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL）等刺激物的作用下表达于多种巨噬细胞中，调节巨噬细胞炎症反应[5]、极化[6]、吞噬作用[7]、凋亡[8]、线粒体代谢[5]、脂质沉积[9]、细胞外基质重塑[10]、免疫耐受[10]以及在肠道黏膜血管周围的定位[11]等功能。Nur77/NR4A1在巨噬细胞中的作用可因细胞类型及刺激物的不同而各异，既可抑制巨噬细胞炎症反应，亦可促进巨噬细胞炎症反应，表现出多变而多效的生物学效应。现对Nur77/NR4A1在巨噬细胞炎症反应中的作用及机制进行综述，以便更好地了解巨噬细胞相关炎症性疾病的分子机制。

1Nur77/NR4A1结构特点

Nur77/NR4A1由定位于人12号染色体的立早基因Nur77，又名NR4A1、NGFIB、TR3、NAK1、GFRP1、HMR、N10、NP10編码。Nur77/NR4A1蛋白由598个氨基酸组成，包含A/B、C、D、E 5个结构域。A/B区为包含非配体依赖转录激活区（activation function，AF）1的N端转录激活结构域（transactivation domain，TAD）;C区位于中央区，为高度保守的锌指DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）;D区为可增加灵活性的铰链区;E区为包含AF2的C端配体结合结构域（ligand binding domain，LBD）[12]。REHMAN等[13]在小鼠中鉴定出两种缺乏TAD的Nur77/NR4A1蛋白亚型，这些亚型主要定位于细胞核外，提示在Nur77/NR4A1从细胞核转移至细胞质的过程中TAD或许是必需的。DBD可特异性识别靶基因启动子上的NGFIB反应元件（NGFIB response element，NBRE，序列为AAAGGTCA），以单体或同源二聚体的形式与NBRE结合从而调节这些靶基因的表达水平。Nur77/NR4A1亦可以异源二聚体的形式与Nur反应元件[序列：AAT（G/A）（C/T）CA]相结合。除此之外，Nur77/NR4A1还可以通过与视黄醇X受体形成异源二聚体与靶基因上的DR5反应元件（序列：AGGTCANNNAAAGGTCA，N为任意单核苷酸）结合来调控靶基因的转录[14]。LBD为数个疏水氨基酸残基形成的配体结合口袋，包含一个配体依赖的AF2转录激活结构域，目前尚未发现其内源性配体[12]。

2Nur77/NR4A1在巨噬细胞中的表达

在正常生理状态下，Nur77/NR4A1低表达或不表达于巨噬细胞，而在多种刺激物的作用下，可高表达于各种类型巨噬细胞，发挥多效调节作用。腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage，PM）在大肠杆菌刺激后Nur77 mRNA表达水平随着时间的推移而升高，在4小时达到顶峰后逐渐下降[15];同样，PM在Kdo lipid A刺激2小时后Nur77 mRNA表达水平亦显著升高[16]。VARGA等[17]采用基因芯片检测小鼠胫前肌炎症组织中Ly6C+ F4/80low和 LyC6 F4/80high巨噬细胞基因表达谱，结果发现Nur77/NR4A1在两种巨噬细胞亚群中均呈现高表达。小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived macrophage，BMM）[18]及血Ly6C+单核细胞[16]在LPS刺激后Nur77 mRNA表达水平均较刺激前明显升高。分别使用LPS及TNFα刺激人血循环原代巨噬细胞及佛波酯诱导THP1来源的巨噬细胞，亦可诱导Nur77 mRNA高表达[19]。oxLDL刺激则可通过激活p38MAPK信号通路诱导RAW264.7巨噬细胞高表达Nur77/NR4A1[8]。使用LPS+zVAD刺激RAW264.7巨噬细胞，与对照组及单独使用LPS或zVAD刺激相比，可诱导Nur77 mRNA及蛋白表达水平显著升高，且该作用依赖于MEF2活性及ERK信号转导通路，Nap为其中主要靶标[20]。BONTA等[19]对来自8名器官捐献者的主动脉进行原位杂交和免疫组化检测，结果显示主动脉粥样硬化病灶处巨噬细胞Nur77 mRNA及蛋白水平呈高表达，且定位于细胞核中。

3Nur77/NR4A1与巨噬细胞炎症反应

Nur77/NR4A1在巨噬细胞炎症反应中的作用是细胞类型及刺激物依赖的，不同种类的巨噬细胞在不同的刺激物作用下，可发挥抗炎、促炎作用，亦可能毫无作用。

3.1Nur77/NR4A1减轻巨噬细胞炎症反应使用微阵列芯片对Nur77/BMM和野生型BMM进行转录谱测绘，IPA通路分析发现炎症反应、细胞间信号传导及相互作用、血液系统发育、细胞移动和免疫细胞迁移在Nur77/BMM中激活，提示在Nur77/BMM中炎症反应增强[10]。HAMERS等[18]发现Nur77/BMM 在LPS刺激后白介素（Interlukin，IL）12、干扰素（Interferon，INF）γ较野生型BMM显著升高，而IL6、IL1β表达水平在野生型BMM中升高更为明显，单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP1）与TNFα在野生型与Nur77/BMM中表达无显著差异。HU等[21]发现RAW2647巨噬细胞、Nur77 DBD或TAD缺陷RAW264.7细胞经oxLDL刺激后炎症因子TNFα及IL12蛋白表达水平均明显升高，而Nur77过表达则反之。提示Nur77/NR4A1可抑制oxLDL诱导的巨噬细胞炎症反应，且此作用依赖于其转录活性。而在oxLDL刺激的THP1巨噬细胞中，过表达Nur77或使用Nur77激动剂CsnB均可上调转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）、CD40 mRNA表达水平，下调IL1β、IL6、IL12、TNFα、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）、细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule1，ICAM1）、核因子NFκB（nuclear factor kappaB，NFκB）mRNA表达水平;过表达Nur77可下调血管细胞黏附分子（Vascular Cell Adhesion Molecule1，VCAM1）表达，Nur77敲减则上调其表达，CsnB预处理对VCAM1表达水平无明显影响[9]。LPS或TNFα刺激人血循环原代巨噬细胞及佛波酯诱导THP1来源的巨噬细胞后，炎症因子IL1β、IL8、MIP1α/β、MCP1表达水平显著上升，而过表达Nur77可使上述因子表达水平下降，Nur77敲减则增加LPS诱导的THP1 IL1β、IL8、MCP1表达水平[19]。以上结果均提示Nur77/NR4A1在多种巨噬细胞炎症模型中均具有抗炎症作用。

3.2Nur77/NR4A1促进巨噬细胞炎症反应PEI等[22]使用基因芯片对过表达Nur77的RAW264.7巨噬细胞及空载体RAW264.7巨噬细胞进行转录组学分析，结果提示表达差异最为显著的基因涉及炎症信号转导通路（MARCKS、NIK、Ikki/Ikk∈）、细胞周期调控（cyclin D2）及凋亡（cathepsin E）。使用real time PCR对转录组学结果进行验证，发现Nur77过表达RAW264.7细胞富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物（myristoylated alaninerich C kinase substrate，MARCKS）、NFκB诱导激酶（NFκBinducing kinase，NIK）、IκB 激酶（INFκB kinase，IKK） i/IKK∈、cyclin D2、cathepsin E mRNA表达水平均高于空载体组细胞。为除外细胞特异性所导致的表达水平改变，作者随后使用了J774A.1 巨噬细胞进行验证，Nur77过表达J774A.1巨噬细胞MARCKS、NIK、IKKi/IKK∈、cyclin D2、cyclin E2、cathepsin E mRNA表达水平均高于空载体组J774A.1细胞[22]。对小鼠IKKi基因启动子进行DNA序列分析，发现在其近端420bp处存在一个潜在NBRE。凝胶迁移实验显示Nur77可与IKKi的NBRE结合，而无法与突变的NBRE结合。将包含IKKi启动子1107 bp至+22bp的荧光素酶报告基因与表达Nur77的质粒共转染至RAW264.7细胞中，结果提示Nur77可激活IKKi启动子，而NBRE突变则降低RAW264.7细胞对Nur77过表达及LPS的反应。说明Nur77/NR4A1可与IKKi启动子中的NBRE直接结合而调控IKKi的表达。而分别使用LPS及PolyI：C刺激RAW264.7细胞，结果显示Nur77过表达组细胞MARCKS、MX1、TNFα、IP10及cyclin D2表达水平均高于空载体组。这提示在TLR3及TLR4配体活化的巨噬细胞中，Nur77/NR4A1通过与IKKi直接结合，发挥促炎介质的作用[22]。

3.3Nur77/NR4A1对巨噬细胞炎症无调节作用HAMERS等[15]分离野生型小鼠与Nur77/小鼠PM进行体外培养，观察大肠杆菌刺激后炎症因子TNFα、IL6、IL1β，趋化因子MCP1、RANTES、MIP2，以及TLR抑制因子SOCS1、A20及IRAKM mRNA表达水平的变化。结果显示，上述因子在野生型与Nur77/ PM的表达无显著差异。提示Nur77/NR4A1在PM应对大肠杆菌感染的炎症反应中并未发挥作用。CHAO等[6]发现野生型与Nur77/BMM在LPS刺激后IL6、IL2b、iNOS及TNFα mRNA表达水平均明显升高，但两者之间差异无统计学意义，同样的结果亦出现于巯基乙酸盐诱导的PM，提示Nur77/NR4A1对LPS刺激的BMM和PM炎症反应无调节作用。

3.4Nur77/NR4A1调节巨噬细胞炎症反应的机制 （1）调控NFκB信号通路介导的巨噬细胞炎症反应。在LPS刺激的RAW264.7细胞中过表达Nur77可通过抑制NFκB信号通路下调促炎因子TNFα和MIF1、趋化因子MCP1 mRNA表达，上调保护性细胞因子IL10 mRNA表达，而对IL6和KC mRNA表达无影响[23]。Nur77/小鼠PM经KLA刺激后，IL12、iNOS、磷酸化p65 NFκB表达水平均显著高于野生型小鼠PM;而使用NFκB抑制剂BAY117082预处理则可通过阻断p65 NFκB磷酸化降低LPS誘导的炎症反应。提示Nur77/NR4A1缺陷可通过调控NFκB信号转导通路促进LPS诱导的PM炎症反应[16]。如前所述，Nur77/NR4A1可通过与IKKi直接结合，而调控巨噬细胞炎症反应。（2）调节巨噬细胞线粒体代谢重编程。DUCO等[5]采用ChIPseq及RNAseq方法对高表达Nur77的RAW264.7巨噬细胞进行了全基因组结合位点以及转录组学检测，使用BETA软件包将ChIPseq和RNAseq数据联系起来以识别Nur77直接调控的基因并进行信号通路分析。结果发现，在上调基因中匹配上532个Nur77结合位点，主要涉及溶酶体、免疫系统、脂质/脂蛋白代谢、糖代谢及分枝杆菌感染，在下调基因中连接上649个结合位点，主要涉及免疫系统、细胞因子信号通路、干扰素信号通路、适应性免疫系统、直接p53效应因子。随后作者对Nur77/NR4A1在线粒体代谢中的作用进行了系列研究。首先，Nur77/BMM线粒体数量较野生型显著减少，且可观察到较野生型更为广泛的溶酶体与线粒体共定位，提示Nur77/NR4A1敲除可增加BMM线粒体自噬。在LPS刺激前后，Nur77/BMM相对野生型BMM而言均高表达线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）亚型（Idh2，Idh3b，Idh3g），而细胞质IDH（Idh1）及其他三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环酶基因则很大程度上无变化，Nur77过表达则表现出相反的结果，提示Nur77/NR4A1下调线粒体IDH亚型。其次，代谢组学分析提示，在LPS刺激后，与野生型BMM相比Nur77/BMM表达更高的α酮戊二酸及TCA循环下游中间产物，而产生较少的乳酸，异柠檬酸/α酮戊二酸比值更低，这提示IDH除亚型变化外还出现活性增加。Nur77/BMM在LPS刺激后NADH/NAD+ 增加，2羟戊二酸水平增加，进一步证实Nur77/NR4A1敲除可导致LPS诱导的BMM TCA循环活性增加及促炎代谢产物生成增多。最后，Nur77/NR4A1敲除可增加LPS诱导的BMM及RAW264.7细胞琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）介导的线粒体呼吸，增加LPS诱导的BMM的SDH活性。SDH促进线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加亦可使促炎转录因子低氧诱导因子α（hypoxia inducible factorα，HIFα）稳定性增加。线粒体ROS主要由电子传递链（electron transport train，ETC）的复合体I产生，复合体I将CTA循环衍生NADH氧化与辅酶Q偶联。使用△ψm insensitive Mito Tracker Green FM和△ψm sensitive Mito Tracker Red CMH2 Xros进行流式细胞学检测，结果提示更多的Nur77/BMM出现线粒体超极化，Nur77/BMM及RAW264.7细胞在LPS刺激后较野生型产生更高水平的ROS（线粒体及全细胞）及HIFα。这些结果提示Nur77/NR4A1敲除使LPS刺激的BMM线粒体膜超极化增加，ROS生成增多，SDH介导的HIFα稳定性增加。在促炎巨噬细胞中，SDH介导的HIFα稳定可导致除TNFα以外的炎症因子产生增加。RNAseq提示，Nur77敲除BMM表达更高水平的SDH调节的促炎因子基因，包括IL1b、IL6、IL12a、IL12b及IL18，抗炎因子IL10下调，而促炎因子基因Tnf无改变。在Nur77敲除BMM中过表达Nur77则导致IL1b、IL6基因表达水平下降，Tnf则无变化。相应地，LPS刺激的Nur77敲除BMM中IL6、IL12p70和IL1β蛋白表达水平升高，IL10表达水平下降，TNFα则无改变。LPS刺激的Nur77敲除BMM高表达琥珀酸受体Sucnr1（GPR91）及促炎因子IL18及IFNγ，野生型BMM则无。结合前述，提示Nur77/NR4A1敲除BMM的SDH活性增加，导致LPS刺激后Nur77/BMM促炎因子产生增多。

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（收稿日期：2020-05-05修回日期：2020-05-12）

（編辑：梁明佩）