丙酮酸钠对严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能不全的保护作用

宁丽萍，王占科，周方强，郭 靓，王庆莅，袁美晶，赵婉茹，张益明

多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是指机体在严重感染、创伤、休克后相继或同时出现两个及两个以上系统或者器官功能不全或衰竭的全身综合症状[1-2]。严重烫(烧)伤后经常会发生器官结构和功能的损伤[3]，住院重症患者中发生MODS的病死率高[4-5]。严重MODS同时会出现不同程度的全身炎症反应[6]，胰腺组织容易受损，炎性细胞因子可以使胰岛β细胞凋亡，胰岛素分泌不足，导致伤后高血糖[7]。丙酮酸钠是常见的丙酮酸盐，分子式为C3H3NaO3，其在生物体系的三大物质代谢中起着重要的枢纽作用，也是强有力的抗氧化和抗炎剂[8]。有研究显示，丙酮酸钠对心肌细胞、神经细胞、红细胞等组织细胞功能具有保护作用[9]，但针对丙酮酸钠保护严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能的研究甚少。本研究探讨丙酮酸钠对严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能的影响，为临床早期诊断和防治MODS提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与材料 选取6～8周龄清洁级健康昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各半[购于江西中医药大学实验动物科技中心，实验动物生产许可证号：SCXK(赣)2018-0003，质量合格证号：0001665]；丙酮酸钠(美国Sigma公司，Lot：WXBB1321V，分析纯)；内毒素(E.coli 055:B5，美国Sigma公司，Lot:028M4094V，分析纯)；水合氯醛(天津市福晨化学试剂厂，Lot：20131022，分析纯)；血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血肌酐(Cr)、肌酸激酶MB型同工酶(CK-MB)、血糖生化试剂盒购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；白介素-6(IL-6)试剂盒购于北京热景生物技术股份有限公司；胰岛素试剂盒购于南京建成公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于重庆中元生物技术有限公司。

1.2仪器 BS-2000M型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；DNM-9602G型酶标仪(北京普朗公司)；UPT-3A上转发光免疫分析仪(北京热景生物技术股份有限公司)；CTK-120型自动脱盖离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HH-W600型恒温水浴箱(常州金坛恒丰仪器制造有限公司)。

1.3动物模型制备和分组 140只清洁级健康昆明小鼠在无菌包装条件下，运输至中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院动物实验室[实验室许可证号：SYXK(赣)2013-001]，清洁级小鼠在独立送风全膜终端过滤式(IVC)环境中适应性饲养，雌雄昆明小鼠随机分为健康组(n=20)和MODS实验组(n=120)，MODS实验组随机分为丙酮酸钠治疗组(n=60)和生理盐水对照组(n=60)，两个实验组再随机分为伤后1、3和5 d组(n=20)，相同条件自由喂养。昆明小鼠腹腔注射3.3%水合氯醛麻醉[10]，根据参考文献[11]小鼠背部剪毛后，将剪毛处置于90℃水浴锅中烫10 s，造成30%体表面积的Ⅲ度严重烫伤(经病理切片证实)，伤后2 h腹腔注射内毒素(按5 mg/kg体重注射：1.0 mg/ml，5.0 ml/kg)[12]，同时腹腔注射生理盐水1.0 ml抗休克，再于烫伤后8 h腹腔注射生理盐水1.0 ml，严重烫伤小鼠于1 d后检测ALT、血Cr、CK-MB、IL-6等指标显著高于健康组，并持续到伤后5 d，为严重烫伤MODS动物模型制备成功。

1.4给药剂量和途径 丙酮酸钠治疗组：参考文献[13]配制2.5%的丙酮酸钠液体：丙酮酸钠4.48 g、氯化镁0.05 g、氯化钙0.183 g、氯化钠5.38 g溶于750 ml重蒸水中，加入10%的葡萄糖注射液250 ml，最后用稀盐酸下调pH值为4.5，过滤消毒，分装4℃保存，使用前用恒温箱孵热至37℃备用，待小鼠Ⅲ度严重烫伤后2 h腹腔注射内毒素，同时腹腔注射2.5%丙酮酸钠1.0 ml抗休克，再于伤后8 h腹腔注射2.5%丙酮酸钠1.0 ml。生理盐水对照组注射等量无菌生理盐水。

1.5样品采集及测定指标 丙酮酸钠治疗组和生理盐水对照组小鼠分别于伤后1、3、5 d心脏采血[14]，小鼠饲养环境温度控制在21～25℃，空气湿度保持在50%～55%，伤前健康组适应性喂养3 d后空腹12 h心脏采血[15]，及时分离血清，置于-80℃超低温冰箱保存，待检，标本统一冻融，采用酶法严格按照试剂盒说明书检测血清ALT、Cr、CK-MB、血糖水平，SOD采用邻苯三酚底物法在全自动生化仪上检测；胰岛素采用ELISA法在北京普朗DNM-9602G型酶标仪上检测,稳态模型β细胞功能指数(HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5)[16]；IL-6用上转发光法在UPT-3A上转发光免疫分析仪上检测。

2 结果

2.1小鼠存活情况 Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠生理盐水对照组和丙酮酸钠治疗组伤前和伤后1、3、5 d存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠不同时间存活情况[只(%)]

2.2主要脏器功能指标情况 丙酮酸钠治疗组和生理盐水对照组伤后1、3、5 d血清ALT、Cr、CK-MB高于健康组(P<0.01)；丙酮酸钠治疗组伤后1、3、5 d血清ALT、Cr、CK-MB水平低于生理盐水对照组(P<0.01)。见表2。

表2 3组小鼠血清ALT、Cr和CK-MB水平变化

2.3血清IL-6和SOD水平 丙酮酸钠治疗组和生理盐水对照组IL-6水平高于健康组，SOD水平低于健康组(P<0.01)；丙酮酸钠治疗组伤后1、3、5 d的IL-6水平低于生理盐水对照组(P<0.01)；丙酮酸钠治疗组伤后1 d SOD水平与生理盐水对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，伤后3、5 d SOD水平高于生理盐水对照组(P<0.01)。见表3。

表3 3组小鼠血清IL-6和SOD水平变化

2.4HOMA-β水平 健康组HOMA-β水平为341.56±35.97，生理盐水对照组伤后1、3、5 d HOMA-β水平分别为163.28±17.90、131.44±15.20、137.07±16.45，丙酮酸钠治疗组分别为252.75±26.71、245.73±23.00、256.79±26.73。生理盐水对照组伤后1、3、5 d HOMA-β水平低于健康组，丙酮酸钠治疗组1、3、5 d的HOMA-β水平高于生理盐水对照组(P<0.01)。

3 讨论

MODS在临床中是常见的医学主要问题，病死率高[17]，动物的MODS诊断定在致伤后24 h，发生多器官功能障碍诊断依据和人类的基本一致，采用实验室诊断指标也基本相同[18]，本实验诊断指标主要选择ALT、Cr、CK-MB和IL-6。IL-6是二级炎症反应介质的主要成分，有多种生物活性，可以敏感反映组织损伤的程度[19]，严重MODS时机体会发生不同程度的全身炎症反应[20]，炎性因子可以使得胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素分泌下降造成绝对或相对不足[7]。胰岛β细胞是胰岛细胞的一种，约占胰岛细胞总数的70%[21]，创伤后机体还会存在胰岛素抵抗造成血糖浓度升高，血糖应激过度会进一步促进炎症感染的发展[22-23]，稳定血糖浓度在适当的范围对MODS的预后至关重要[24]，HOMA-β可以作为判断MODS患者病情转归和预后的预警指标[17，25-26]。

据文献综述报道，丙酮酸钠是人体内源性的一类小分子的化合物，不仅在红细胞、血管内皮细胞、视神经细胞等组织细胞有保护作用，外源性的丙酮酸钠还可以在严重缺氧的情况下保护组织和器官的功能[9]，且无不良反应[27]，在缺氧性乳酸性酸中毒(LA)中也具有潜在的临床应用价值[28]。但是将丙酮酸钠应用在胰腺组织对胰岛β细胞功能的保护作用鲜有报道，外源性的丙酮酸钠可以通过腹腔复苏提高细胞的缺氧耐受性，防止器官功能障碍及衰竭,提高实验动物的生存率[29-30]，直接腹腔复苏还可以增加57%的胰腺血流量[31]。

本研究结果显示，昆明小鼠制作Ⅲ度严重烫伤MODS模型时全部使用国内较常用的麻醉药水合氯醛腹腔注射进行麻醉[32]。丙酮酸钠治疗组伤后1、3、5 d ALT、Cr、CK-MB及IL-6低于生理盐水对照组，提示使用丙酮酸钠腹腔注射可降低Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠主要器官功能的损伤程度。丙酮酸钠治疗组伤后3、5 d SOD水平均高于生理盐水对照组，可能是由于严重烫伤后，小鼠机体容易产生氧化应激反应，而SOD是生物体内非常重要的抗氧化酶，是清除氧化应激反应所产生的氧自由基的主要物质[33-34]，文献报道丙酮酸钠可以减少氧自由基的含量，减少炎性细胞的浸润，减轻对脏器的损伤[35-36]，可能是通过促进SOD发挥作用或产生协同作用达到减轻损伤的效果。本研究结果显示，丙酮酸钠治疗组各时间点HOMA-β水平高于生理盐水对照组，提示丙酮酸钠治疗后胰岛功能损伤有改善。胰腺组织中胰岛β细胞调控细胞凋亡来稳定血糖具有重要作用[37]，使用小容量的高渗丙酮酸钠液较大容量的丙酮酸乙酯液更有效[38]。

综上所述，本实验制作的30% TBSAⅢ度严重烫伤MODS小鼠模型，让其发生不同程度的全身炎症反应，氧化应激与炎性因子在疾病的发展中起到重要作用，使用丙酮酸钠改善症状有效果。腹腔注射丙酮酸钠液可以降低心脏、肝脏、肾脏功能酶指标，降低胰腺组织氧化应激,增加SOD浓度及降低IL-6水平，改善HOMA-β水平，实现严重烫伤MODS胰腺组织胰岛β细胞功能不全的保护作用，丙酮酸钠治疗组和生理盐水对照组小鼠存活率比较差异无统计学意义，可能与小鼠数量少有关。本研究得出的结论仅是从动物实验中获得的，在临床研究中是否也具有这种保护作用可能需要进一步的探讨。