早期结直肠癌组织中PGC-1α、NF-κB p65的表达及与临床病理特征和预后的相关性分析

杨亚玲，周 宁，黄 丹

结直肠癌是发生于结肠与直肠的常见恶性肿瘤，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果[1]。由于该疾病早期无明显症状，一旦确诊，患者往往处于疾病的中晚期，故结直肠癌的早期诊断对患者的治疗及预后具有重要意义[2]。过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α(peroxisome proliferator ivated receptor γ coactivator-1α， PGC-1α)是一种能与多种转录因子发生反应的多功能核转录因子，该因子与肿瘤的发生与发展具有紧密联系[3]。而核因子-κB(nuclear factor-κB， NF-κB)p65则被证实在肿瘤组织中参与细胞增殖等多个步骤[4]。本研究分析结直肠癌患者PGC-1α和NF-κB p65的表达及与临床病理特征和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2015年11月—2017年11月收治的75例结直肠癌患者作为研究对象，均经手术或穿刺活检证实。男42例，女33例，年龄25～76(59.31±8.65)岁。纳入标准：术前未接受化疗、放疗等抗癌辅助治疗；本研究经医院医学伦理委员会审核通过，临床资料均完整；无其他恶性疾病；患者均签署知情同意书。排除标准：合并肝、肾、心脏等脏器严重疾病者；妊娠期或哺乳期妇女；合并严重神经功能、认知功能障碍者；严重高血压、糖尿病、冠心病者；有药物过敏史者。

1.2仪器与试剂 10%甲醛溶液、石蜡、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR仪(美国ABI-7500 Real-Time PCR)、磷酸盐缓冲液(PBS，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)、免疫组化二抗试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(英国Abcam公司)、PGC-1α抗体(英国Abcam公司)。

1.3检测方法

1.3.1PGC-1α表达检测：由相关专业操作人员用Trazol溶液将黏膜组织样本的总RNA进行提取，并严格按照试剂盒说明合成cRNA。合成完毕后取2组cDNA 5 μl，将其作为模板，再分别加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并经过高温变性、循环，再进行PCR仪检测。将PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，参考DL2000 marker分子质量标准进行紫外凝胶扫描成像，该样本的表达相对强度则为与样本内对照β-actin的荧光强度比值。

1.3.2NF-κB p65表达检测：取受检者黏膜组织，在30 min内将黏膜组织置于10%甲醛溶液中固定浸泡，予以石蜡包埋切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇予以脱水，并使用枸橼酸盐修复液对组织进行3 min的高压修复，修复完成后用免疫组化笔在受检组织1～2 mm外划圈，再加入3% H2O2放置于恒温箱中孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶干扰，并运用磷酸盐缓冲液漂洗，漂洗3次后加入适量的10%正常羊血清于室温下密闭15 min，弃血清，并以1∶500的稀释比例滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗体放置于4℃的恒温箱中过夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。各组标本均将PBS代替一抗作为阴性对照，以自身对照作为阳性对照。

1.4结果判定 PGC-1α、NF-κB p65免疫组化结果判定[5]：由两位病理科医生在400倍光镜下随机选取10个视野对染色细胞数量和染色程度评分，阳性细胞数量<1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，>50%为3分；染色程度:无染色为0分，弱阳性显黄色为1分，中等阳性显浅棕色为2分，强阳性显棕褐色为3分。将二者所得分数合计：无表达或低表达为0～3分，高表达为4～6分。

2 结果

2.1PGC-1α与NF-κB p65在不同组织中的表达 PGC-1α与NF-κB p65在癌组织中高表达率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 PGC-1α与NF-κB p65在结直肠癌癌组织和癌旁组织中的表达情况[例(%)]

2.2PGC-1α表达与结直肠癌癌组织临床病理特征的关系 PGC-1α在结直肠癌中的高表达率与肿瘤分化程度呈反比(P<0.01)；TNMⅠ～Ⅱ期、淋巴结无转移且(或)无血管侵犯的结直肠癌患者PGC-1α表达率明显低于Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结有转移、血管受侵犯的患者(P<0.01)；而患者年龄、性别、肿瘤大小与PGC-1α表达无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 PGC-1α水平与结直肠癌临床病理特征关系(例)

2.3NF-κB p65表达与结直肠癌癌组织临床病理特征的关系 结直肠癌癌组织中NF-κB p65的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)；TNM分期处于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移者、有血管侵犯、肿瘤分化程度低的患者NF-κB p65的表达明显高于TNMⅠ～Ⅱ期、肿瘤分化程度高、无淋巴结转移、无血管侵犯患者(P<0.01)。见表3。

表3 NF-κB p65与结直肠癌临床病理特征关系(例)

2.4PGC-1α与NF-κB p65表达与结直肠癌病理特征的相关性分析 经Spearman相关进行分析，结直肠癌患者PGC-1α与NF-κB p65的表达水平与肿瘤分化程度呈负相关，与TNM分期、血管侵犯程度、淋巴结转移呈正相关(P<0.01)。见表4。

表4 PGC-1α与NF-κB p65与结直肠癌病理特征的相关性

2.5预后情况 随访2年后，75例结直肠癌患者2年总生存率为73.33%(55/75)。PGC-1α高表达和低表达的2年总生存率分别为74.14%(43/58)、70.59%(12/17)，不同表达水平生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)；NF-κB p65高表达和低表达的2年总生存率分别为73.08%(38/52)、73.91%(17/23)，不同表达水平生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

结直肠癌是发生于结、直肠及肛管黏膜上皮的恶性肿瘤，患者预后较差，病死率较高，对人类的健康造成严重威胁[6]。近20多年来，世界上多数国家结直肠癌的发病率呈上升趋势，而我国的发病率上升趋势也十分明显[7]。而关于早期诊断、治疗以及相关分子生物学研究一直是临床研究的热点，有大量文献指出，结直肠癌的发生、发展与细胞增殖、分化失控及凋亡障碍等因素密切相关[8]。

PGC-1α是一种通过与多种转录因子结合并对其基因的转录、转录后的剪接修饰予以调控的核转录因子[9]。近年来有大量文献已经证明PGC-1α与多种肿瘤的发生、发展具有相关性，PGC-1α的表达在前列腺癌、胃癌中均呈高水平状态，该因子还可诱导乙型肝炎病毒发生复制、转录，进而导致肝癌的发生，对癌症的发展具有促进作用[10-11]。而也有相关实验研究表明，PGC-1α可诱导雌激素相关受体，从而使前列腺癌的转移受到抑制；在乳腺癌癌细胞不断增殖时，PGC-1α可通过miRNA的作用减少癌细胞的增殖[12-13]，提示PGC-1α不仅是一种促癌因子，通过相关信号因子与癌基因的调控还可成为一种抑癌因子，该结论对恶性肿瘤靶向治疗的研究提供了方向[14-15]。

NF-κB是一种多向性转录调节因子，包括p65和p50两种亚型，对多种细胞因子、黏附因子以及生长因子的表达具有调控作用，与炎症的发生也存在关联。有相关研究证明，NF-κB在肿瘤组织中表达过量将加速肿瘤的发展，而NF-κB p65在细胞中主要参与基因转录的调节[16-17]。有相关动物实验证实，NF-κB p65在正常组织、炎性组织及癌组织中的表达呈上升趋势，其基因敲除将导致小鼠的死亡[18]。本研究结果显示，NF-κB p65、PGC-1α在结直肠癌患者癌组织中的表达率显著高于癌旁组织，这有效验证了上述研究结果，也在一定程度证明了NF-κB p65、PGC-1α表达在结直肠癌的发病过程中发挥了不可或缺的作用，有可能随着病情的发展其表达水平逐渐升高。

本研究还发现，NF-κB p65、PGC-1α的表达与患者年龄及肿瘤大小无相关性，而与结直肠癌的TNM分期、淋巴结转移及血管侵犯程度呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关，提示NF-κB p65、PGC-1α参与了结直肠癌病变过程，在一定程度可能对肿瘤细胞及相关因子的分泌和增殖产生了促进作用，这与吴安定等[19]研究结果一致。

通过我们对手术后患者2年的随访，分析NF-κB p65及PGC-1α表达与患者生存率的关系，结果显示二者表达的差异对结直肠癌患者术后生存情况无影响，而王婷婷等[20]研究结果显示，PGC-1α的表达与患者病情发展呈一致性，本研究与其存在一定的差异性，考虑为本研究病例数及随访时间有限所致，具体情况还需进一步予以讨论研究。

综上所述，NF-κB p65与PGC-1α表达在结直肠癌的发生、发展及血管侵犯等过程中发挥着重要作用，临床可根据NF-κB p65与PGC-1α表达情况对患者病情进行诊断与治疗指导。