双靶向紫杉醇聚酰胺聚合物胶束体外抗肿瘤作用及机制

赵红阳 王莹 盛世东 姜琳 刘月平 赵庆兰

(1吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130021；2吉林省肝胆病医院；3解放军九六四医院)

紫杉醇(PTX)最早是在紫杉的树叶、树皮、嫩枝等部位提取分离得到的天然物质，是目前临床上被广泛应用的抗肿瘤化疗药物〔1～5〕。PTX的溶解性问题是其制剂的首要问题〔6～8〕。另外，PTX作为细胞毒性的抗肿瘤药物，因为缺乏肿瘤靶向性，甚至导致全身性毒性〔7〕，特别是中性粒细胞减少症等免疫性疾病，这使得其临床应用受到很大限制〔10～12〕。前期研究中已制备出以聚酰胺聚合物(PAMAM)-聚乙二醇(PEG)为骨架的叶酸(FA)/透明质酸(HA)双靶向载PTX胶束，载药量为18.5%，本研究拟分析FA/HA双靶向PTX-PAMAM胶束体外抗肿瘤作用及机制。

1 材料与方法

1.1试剂 PTX购自大连美仑生物技术有限公司；PAMAM购自威海晨源分子新材料有限公司；透析袋、NH2-PEG2000-COOH均购自北京索莱宝科技有限公司；二甲亚砜、十水合四硼酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；硼酸购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺、HA、FA、十八胺、N,N一二环己基碳二亚胺、甲酰胺、N,N一二甲基甲酰胺均购自麦克林；人乳腺癌(MCF-7)细胞株购自南昌乐悠生物科技有限公司。

1.2仪器 酶标仪(Biocell)；超净工作台(AIR TECH)；倒置显微镜(OLYMPUS CK40)；流式细胞仪美国(BD公司)；细胞培养箱(三洋电机株式会社)；激光共聚焦显微镜FV1000(Olympus公司)。

1.3细胞培养 DMEM培养基中加入双抗、10%胎牛血清，用于培养MCF-7心肌细胞，当细胞的贴壁密度处于70%～80%时，用含有0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶轻轻吹打消化、传代至所需培养皿中进行实验。

1.4MTT检测细胞存活率 Control组(空白对照组加入同等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)〕、胶束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)刺激12、24、48、72 h，进行MTT检测，采用96孔板接种细胞，细胞密度为1×106个/孔，培养24 h后给药，进行孵育，每孔加入20 ml MTT(5 g/L)，在37℃细胞培养箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀后，用酶标仪检测570 nm处的各孔OD值。细胞增殖率=OD处理孔/OD阴性对照孔×100%。

1.5流式细胞仪检测胶束的细胞摄取情况 采用6孔板接种细胞，分组给药后，在37℃细胞培养箱放置24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后进行封片，加入2 ml培养液运用流式细胞仪检测荧光，流式细胞仪的激发波长设置为488 nm。实验分组：①时间依赖性梯度：胶束(10 μg/ml)刺激0.5 h、1.0 h、2.0 h、6.0 h、8.0 h、24.0 h。②胶束上的FA基团与受体结合能力：Control组(空白对照组加入同等体积的PBS)、FA(1、10、25 mg/ml)预处理1 h。③胶束的细胞内吞机制：Control组、蔗糖组(网格蛋白介导的细胞内吞抑制剂，0.45 mol/L)、氯丙嗪组(网格蛋白介导内陷抑制剂，10 μg/ml)、秋水仙碱组(巨胞饮抑制剂，10 μmol/L)、吲哚美辛组(小窝蛋白介导的细胞内吞抑制剂，100 μmol/L)。

1.6共聚焦显微镜检测胶束的胞内定位 采用6孔板接种细胞，分组给药后，在37℃细胞培养箱放置24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后进行封片，加入2 ml培养液运用共聚焦荧光显微镜检测荧光，胶束的荧光显微镜的激发波长设置为488 nm(绿色)，用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色，DAPI的激发波长为 358 nm(蓝色)。实验分组：溶酶体红色荧光探针组、线粒体红色荧光探针组、高尔基体红色荧光探针组、内质网红色荧光探针组。利用异硫氰酸荧光素(FITC)(绿色荧光)标记胶束，ER-Tracker红色荧光探针标记内质网，Golgitracker红色荧光探针标记高尔基体，Mitotracker红色荧光探针标记线粒体，Lysotracker红色荧光探针标记溶酶体，DAPI蓝色荧光探针标记细胞核，通过激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中胶束与各类细胞器的荧光共定位。

1.7统计学方法 采用GraphPad Prism5软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1胶束对肿瘤细胞存活率的影响 体外培养MCF-7肿瘤细胞，用含胶束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)培养基刺激细胞12、24、48、72 h，进行MTT检测。各组细胞生存率均呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性降低趋势。见表1。

表1 各组刺激不同时间点MCF-7细胞活性

2.2胶束的细胞摄取 肿瘤细胞对胶束的摄取呈现时间依赖性增加趋势(胶束刺激0.0、0.5、1.0、2.0、6.0、8.0、24.0 h细胞内荧光密度分别为100%、119%、125%、128%、137%、135%、168%)；随着FA浓度的增加，肿瘤细胞对胶束的摄取呈现浓度依赖性降低趋势(Control组、FA 1、10、25 mg/ml组细胞内荧光密度分别为100%、98%、85%、59%)；较Control组(100%)，秋水仙碱组细胞摄取(76%)明显降低(P<0.05)，氯丙嗪组、吲哚炎率组、蔗糖组(分别为102%、100%、101%)降低不明显。

2.3胶束的细胞内定位 胶束与溶酶体有较强的共定位，提示胶束入胞后大部分聚集在溶酶体中。见图1。

胶束：FITC绿色荧光；内质网：红色荧光；高尔基体：红色荧光；线粒体：红色荧光；溶酶体：红色荧光；细胞核：DAPI蓝色荧光图1 胶束的细胞内定位(×40)

3 讨 论

恶性肿瘤已经成为影响人类健康的主要疾病之一，化疗是主要方法之一〔13～16〕，但化疗药物又存在缺乏靶向性和毒副作用大的缺陷。所以设计构建毒副作用小，靶向性高的抗肿瘤靶向载体系统具有很好的药学研究前景。

本文结果表明，胶束组细胞生存率呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性降低趋势。添加游离的FA可以有效地抑制胶束的摄取，游离的FA与胶束上的FA基团竞争性地结合肿瘤细胞上的FA受体，从而抑制了肿瘤细胞对胶束的靶向性摄取。肿瘤细胞对胶束的摄取依赖巨胞饮内吞机制，内吞后大部分胶束聚集在溶酶体中，而其具体作用机制尚需进一步研究。

综上，FA/HA双靶向PTX-PAMAM胶束在体外呈现明显的抗肿瘤作用，其作用机制与肿瘤细胞对胶束的靶向性摄取、巨胞饮内吞作用及溶酶体聚集相关。