阿尔茨海默病患者外周血差异基因的生物信息学特征分析

张波 白勇涛 刘洪涛 卫东锋 任建廷 张俊英 张占军 赵雪松

(1香河园社区卫生服务中心检验科，北京 100028；2中国中医科学院中医临床基础医学研究所；3北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室；4北京师范大学老年脑健康研究中心；5首都医科大学附属北京天坛医院)

阿尔茨海默病(AD)又称老年性痴呆，多发于老年人，是一种常见的中枢神经系统退行性病变，临床以进行性记忆和认知功能下降、行为异常、社交障碍及睡眠障碍等为主要表现，主要病理特征包括老年斑形成、神经元纤维缠结、海马锥体细胞颗粒空泡变性及神经元丢失等〔1，2〕。目前外周体液标志物的研究已成为AD领域的热点问题。由于脑脊液中Aβ和Tau的含量检测具有一定创伤性无法广泛开展，而人体外周血作为早期AD诊断、筛查的标志物，具有创伤小，易取样，适合在社区卫生服务中心、医院、养老院等广泛开展。在人体外周血中筛选更为敏感的生物标志物是一种具有潜力和临床应用价值的方法〔3，4〕，具有重要的应用前景，将对AD的早期筛查和诊断产生重要影响。基因组学检测方法为AD的病理机制研究及抗AD药物研发提供了大量的临床数据，采用生物信息学分析方法对这些临床检测数据进行深入分析，探讨AD疾病外周血早期的糖脂代谢变化特征，可为AD疾病的早期筛查、诊断、治疗及实验研究提供科学依据〔5〕。

本研究利用来自基因芯片公共数据库(GEO)一组AD患者外周血具有明显差异的基因数据进行生物信息学分析，深入探讨早期AD外周血的糖脂分子功能及蛋白网络改变情况，以期为早期AD的发病机制及药物防治提供理论依据和临床参考。

1 材料与方法

1.1差异明显的基因表达数据 在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“血液和阿尔茨海默病”为检索词，获得GSE97760和GSE4229基因芯片数据。GSE97760由美国Agilent 科技公司生产的Sureprint G3 Human Gene Expression 8x60k v2基因芯片检测，基因数据分别来自9例AD患者和10例健康老年人。GSE4229为人外周血单个核细胞基因芯片数据，该数据由NIA Human MGC cDNA基因芯片检测，基因数据分别来自18例AD患者和22例正常老年人。AD患者血液中表达明显下调和上调的差异基因列表见表1，然后进行生物信息学分析。

表1 AD患者血液中表达下调及上调的差异基因

1.2方法

1.2.1差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析 分别将20个表达下调和上调的明显差异基因相应的蛋白ID号上传至STRING9.05 PPI关系在线分析网站(http://www.string-db.org)，通过调节可信度和附加节点参数，获得差异表达基因的PPI拓扑网络图谱及团簇功能分类网络图谱，并筛选出各子网络的关键节点蛋白。

1.2.2差异表达基因的分类及分子功能分析 分别将20个表达下调和上调的明显差异基因ID号上传至PANTHER 8.1在线分类系统(http://www.pantherdb.org)，通过调节数据种属类型及分析类型参数，调节结果展示图形类别，分别获得上调和下调差异基因表达蛋白的分类、基因分子功能分类结果，进一步查看各分类中详细基因名称及相关信息，对分类结果进行整理。

1.2.3差异表达基因的生物学过程及信号通路分析 在上述数据上传的基础上，进一步调节分析参数及结果展示类型，点击各生物学过程及信号通路分析结果，进一步查看各生物学过程中所包含的所有基因名称及其详细信息，并查看每条信号通路中所涉及的基因数量、基因名称等相关信息。

2 结 果

2.1下调基因的PPI拓扑网络及团簇网络分析结果 如图1所示，STRING蛋白相互作用在线分析结果表明，下调的20个基因表达的蛋白之间存在相互作用关系，构成的蛋白拓扑网络中包含3个子网络，分别与能量代谢、信号传导、氧化应激密切相关。其中，ATP6V1F为能量代谢子网络的中心节点，与子网络中其他16个蛋白存在相互作用关系。PIGQ与信号传导子网络中的4个信号传导蛋白存在相互作用关系，为关键节点。SLC2A5与网络中的两个蛋白存在相互作用关系。GP6与网络中的GP1BB蛋白存在相互作用关系，GLO1为子网络的关键节点，与AK1、HAGH存在相互作用关系。下调基因表达蛋白相互作用拓扑网络中预测的相关功能蛋白见表2，表中列出了10个预测蛋白的全称及所含氨基酸数目。而下调基因的PPI功能团簇网络分析结果见图2，包含3个功能团簇。

2.2上调基因的PPI拓扑网络及团簇网络分析结果 如图3所示，STRING蛋白相互作用在线分析结果表明，上调的20个基因表达的蛋白之间存在相互作用关系，构成的蛋白拓扑网络中包含5个子网络，分别与糖基化修饰、糖原合成、丙三醇代谢、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代谢密切相关。其中，OGT为糖基化修饰相关子网络的关键节点，与子网络中的其他3个蛋白MGEA5、HCFC1、WDR5存在相互作用关系。GYG1为糖原合成子网络的中心节点，与子网络中的其他10个蛋白存在相互作用关系。UXS1为葡萄糖醛酸酯合成相关子网络的关键节点，与子网络中的其他4个蛋白B3GALNT2、POMK、ATPIF1、UGDH存在相互作用关系。ATP2A2为ATP能量代谢子网络的中心节点，与子网络中的其他7个蛋白ATP2A1、ATP2A3、ATP1B1、ATP1A4、ATP1A2、ATP1A1、FXYD2存在相互作用关系。上调基因表达蛋白的相互作用网络中预测的相关功能蛋白见表2，表中列出了10个预测蛋白的全称。上调基因的PPI团簇网络分析结果见图2，包含3个功能团簇。

图1 下调基因的PPI相互作用拓扑网络

下调基因

上调基因

2.3下调基因的GO分类结果 下调基因的GO分类结果包括蛋白分类(蛋白总数20，分类匹配数目16)、分子功能(蛋白总数20，功能匹配数18)、生物学过程(蛋白数20，过程匹配数18)及信号通路(蛋白总数20，通路匹配数目4)。

2.3.1下调基因的蛋白分类及分子功能分析结果 PANTHER平台蛋白分类结果表明，下调基因表达的蛋白可分为8个类别，每种类别包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。PANTHER平台分子功能分类结果表明，下调基因的分子功能可分为4个类别，每种分子功能包含的基因及占总基因数量的百分比见表4。

图3 上调基因的PPI网络

2.3.2下调基因的生物学过程及信号通路分析结果 PANTHER平台生物学过程分类结果表明，下调基因的生物学过程可分为6个类别，每种生物学过程包含的基因及占总基因数量的百分比见表4。

2.4上调基因的GO分类结果 上调基因的GO分类结果包括蛋白分类、分子功能、生物学过程及细胞组分。

2.4.1上调基因的蛋白分类及分子功能分类结果 PANTHER平台蛋白分类结果表明，上调基因表达的蛋白可分为6个类别，每种类别包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。上调基因的分子功能可分为4个类别，包括结合活性、催化活性、分子调节及转运活性，每种分子功能包含的基因及占总基因数量的百分比见表5。

表3 下调基因及上调基因表达蛋白的分类结果

表4 下调基因的生物信息学分析

2.4.2上调基因的生物学过程及细胞组分分类 PANTHER平台生物学过程分类结果表明，上调基因的生物学过程可分为4个类别，每种生物学过程包含的基因及占总基因数量的百分比见表5。

表5 上调基因的生物信息学分析

3 讨 论

AD是一种病因较多、病程较长、危险因素较多、发病机制较为复杂的神经退行性疾病，由于其发病机制研究尚未有定论，因此目前仍缺乏有效的治疗方法〔6,7〕。已有研究表明，由β淀粉样蛋白(Aβ)聚集所形成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化引起的神经纤维缠结是AD的主要病理特征，寡聚化的Aβ对神经细胞具有明显毒性作用，其机制与线粒体能量代谢障碍、氧化应激损伤、炎症反应、突触损伤、Tau蛋白磷酸化、细胞凋亡及细胞代谢紊乱密切相关〔8〕。Tau蛋白过度磷酸化可导致神经细胞微管结构稳定性下降、神经纤维缠结、囊泡转运功能失调及轴突转运障碍，从而引起神经细胞损伤或丢失〔9〕。线粒体能量代谢紊乱是AD早期发生的主要原因之一，进而导致脂代谢和氨基酸代谢紊乱，引起神经细胞微环境紊乱，神经网络功能重塑，以维持大脑的正常生理功能〔10〕。

本研究中基因数据来源于AD患者血液，差异基因主要与能量代谢密切相关。下调基因表达的蛋白主要与转移酶、水解酶、转运分子、细胞黏附分子、防御/免疫蛋白密切相关，分子功能主要与催化活性、转运活性、结合活性密切相关，涉及的生物学过程主要与能量代谢过程、细胞过程、免疫系统过程及定位过程密切相关，如Na+/K+转运三磷酸腺苷酶β2多肽、氢离子转运三磷酸腺苷酶V1亚基、丙酮酸羧化酶、甘露糖(α-1,3-)-糖蛋白-2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶、溶质载体家族2促葡萄糖转运体成员A5、溶质载体家族5促葡萄糖转运体成员A2。而上调基因表达的蛋白主要与转移酶、转运分子、氧化还原酶、分子伴侣、连接酶密切相关，分子功能主要与催化活性、转运活性及分子调节密切相关，涉及的生物学过程主要与代谢过程、细胞过程、生物调节过程及定位过程密切相关，如钙离子转运三磷酸腺苷酶、溶质载体家族5促葡萄糖转运体成员A3、丙三醇激酶、线粒体丙三醇-3-磷酸盐酰基转移酶、线粒体丙三醇-3-磷酸脱氢酶2、增强内质网降解的甘露糖苷酶样蛋白3等。PANTHER平台GO分析结果表明，AD病理过程中，机体线粒体能量代谢、免疫系统防御功能及细胞转运能力明显下降，而机体的生物调节能力、分子调节能力及氧化应激反应等代偿性调节能力明显增强。这可能是机体出现损伤后的一种局部功能重塑，通过基因的整体变化达到新的代谢平衡。

STRING PPI网络分析结果表明，AD患者血液中的差异基因表达的蛋白之间存在相互作用关系，下调基因表达蛋白的PPI蛋白子网络与能量代谢、信号传导、氧化应激密切相关，而上调基因表达蛋白的PPI蛋白子网络与糖基化修饰、糖原合成、丙三醇代谢、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代谢密切相关，其中ATP6V1F、PIGQ、GLO1、OGT、GYG1、UXS1、ATP2A2作为PPT网络的关键节点值得进一步深入研究，为AD的早期筛查和诊断提供线索和依据。

本研究差异基因的生物信息学分析结果表明，AD患者外周血中的差异基因主要涉及催化活性、转运活性、结合活性及分子调节功能，通过调节AD丙酮酸代谢、血凝、嘌呤生物合成信号通路参与能量代谢过程、细胞过程、免疫系统及细胞定位生物学过程，为早期AD患者的外周血早期筛查及诊断研究提供了新思路和防治靶标。综上所述，本研究应用生物信息学方法对AD患者血液中表达下调和上调的差异基因进行了深入分析，筛选出了其中7个重要调节基因，以细胞信号转导通路为主，针对这些差异基因进行深入研究，将有助于进一步揭示AD在早期阶段的发病机制。