H3K27M和Ki-67在小儿脑胶质瘤中的表达及相关性

胡历博 刘伟 朱晋 柴毅 张玉琪

脑胶质瘤在颅内原发性肿瘤中占比最高[1]。肿瘤复发对胶质瘤治疗效果影响最大，可能与肿瘤干细胞迁移有关，尽管目前尝试了一些新的治疗手段，但恶性胶质瘤患者的预后仍较差[2-3]。随着分子生物学的发展，靶向药物可能导致胶质瘤的治疗效果取得突破性进展[4]。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类将H3K27M 突变型弥漫性中线胶质瘤作为一个单独的类型，该病多见于儿童[5]。H3K27M突变型弥漫性中线胶质瘤是一种高侵袭性恶性肿瘤，多由组蛋白H3F3A 基因突变导致，形态多为星形细胞瘤样[6]。Zhao等[7]报道Ki-67在细胞周期的活动期被检测到，可用以评价肿瘤增殖程度。本研究采用免疫组织化学检测小儿脑胶质瘤组织中H3K27M和Ki-67的表达情况，分析其与组织分级、预后等临床指标的关系及探究此两项的表达是否具有相关性，以期为胶质瘤的发生发展研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2013年11月至2018年6月清华大学玉泉医院手术切除并保存完整的人脑胶质细胞瘤标本38例，经病理诊断为脑胶质瘤。其中男性21例（55.3%），女性17例（44.7%）；年龄8个月至14岁，平均年龄5.6岁，＜3岁8例（21.1%），≥3岁30例（78.9%）。病例均有完整临床、影像学和病理资料，并进行随访。根据患者术前MRI及术中实际情况将发病部位分为脑干及非脑干部位，其中脑干部位8例，非脑干部位（小脑半球、松果体区、海马区等部位）30例。按2016年WHO中枢神经系统肿瘤分级标准进行组织学分类与分级，其中Ⅰ级15例（39.5%），Ⅱ级14例（36.8%），Ⅲ级0例，Ⅳ级9例（23.7%）。节细胞胶质瘤13例，星形胶质瘤14例，少突胶质细胞瘤1例，室管膜瘤1例，胶质母细胞瘤9例。同时将其分为低级别组（Ⅰ～Ⅱ级）29例，高级别组（Ⅲ～Ⅳ级）9例。选取10例癫痫患者正常脑组织标本作为对照组。所有患儿均无类风湿、糖尿病、甲状腺功能亢进等其他疾病。本研究获医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 H3K27M 兔单克隆抗体（ZA-0321）和Ki-67鼠单克隆抗体（ZM-0166）均购自北京中杉金桥生物公司。将标本用福尔马林固定、石蜡包埋处理后常规切片制成厚3 μm切片，经烘干、二甲苯脱蜡后用柠檬酸缓冲液高压修复抗原，3%双氧水消除内源性过氧化物酶，加一抗孵育，过夜后冲洗，滴加二抗，常规DAB 显色，苏木精复染等。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 结果判定 免疫组织化学判断标准：每张病理切片随机选取5个（×100）视野，H3K27M属于组蛋白类型，镜下观察到细胞核呈现棕黄色细颗粒状物质沉积反应，为H3K27M 细胞核阳性反应；Ki-67染色表现为细胞核染色为主，镜下观察到细胞核呈现浅黄色至棕褐色则为阳性表现，计算5个高倍镜视野内阳性细胞占比，以≤30%为低标记指数，＞30%为高标记指数[8]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，正常脑组织及人脑胶质瘤组织中表达阳性率的差异采用χ2或Fisher 精确检验，应用Spearman 秩相关分析H3K27M和Ki-67 在胶质瘤组织中表达水平的相关性。生存时间指病理确诊至患者死亡或最后随访时间。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 H3K27M、Ki-67 在小儿脑胶质瘤及正常脑组织中的表达

本研究免疫组织化学结果显示，H3K27M在小儿脑胶质瘤组织中的阳性率为34.2%（13/38）。组织分级中，H3K27M在高级别胶质瘤中的阳性率为77.8%（7/9），低级别胶质瘤中的阳性率为20.7%（6/29）。性别分组中，男性阳性表达率为38.1%（8/21），女性阳性表达率为29.4%（5/17）。年龄分组中，幼儿组（＜3岁）中的阳性表达率为12.5%（1/8），儿童组（≥3岁）中的阳性表达率为40.0%（12/30）。肿瘤部位组中，脑干部位阳性率为62.5%（5/8），非脑干部位的阳性率为26.7%（8/30）。

经Spearman 秩相关分析（表1），H3K27M 阳性表达与性别、年龄、肿瘤部位无显著相关性（P＞0.05），与病理级别有显著相关性（P＜0.05）。H3K27M 在正常脑组织中未见表达，38例人胶质瘤中13例表达，阳性表达率为34.2%（13/38），差异有统计学意义（χ2=4.69，P＜0.05）。H3K27M在低级别胶质瘤中阳性率为20.7（6/29），在高级别胶质瘤中阳性表达率为77.8%（7/9），差异有统计学意义（χ2=9.95，P＜0.05）。

在小儿脑胶质瘤组织中Ki-67的阳性率为100%（38/38），其中Ki-67高标记指数为13.2%（5/38），低标记指数为86.8%（33/38）。组织分级中，高级别胶质瘤中的Ki-67高标记指数为55.6%（5/9），低级别胶质瘤中的高标记指数为0（0/29）。性别分组中，男性Ki-67高标记指数为14.3%（3/21），女性高标记指数为11.8%（2/17）。年龄分组中，幼儿组中的Ki-67高标记指数为12.5%（1/8），儿童组中的高标记指数为13.3%（4/30）。肿瘤部位组中，脑干部位组中的Ki-67高标记指数为37.5%（3/8），非脑干部位组中的高标记指数为6.7%（2/30）。经Spearman秩相关分析（表1），Ki-67高标记指数与性别、年龄无显著相关性（P＞0.05），与病理级别、肿瘤部位有关（P＜0.05）。Ki-67在正常脑组织中未见表达，在38例人胶质瘤中均表达，阳性表达率为100%，差异有统计学意义（χ2=48.0，P＜0.05）。Ki-67在低级别胶质瘤中的高标记指数为0（0/29），在高级别胶质瘤中的高标记指数为55.6%（5/9），差异有统计学意义（χ2=18.55，P＜0.05）。免疫组织化学结果见图1。

表1 H3K27M阳性表达、Ki-67高标记指数与胶质瘤患者各临床指标间的关系例（%）

2.2 Kaplan-Meier生存曲线分析

截至2019年3月，平均随访时间为871 天（30个月）。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果表明性别、年龄、手术方式与患儿生存时间之间无明显关联；病理分级、肿瘤部位、H3K27M蛋白阳性、Ki-67高标记指数与患儿生存时间之间有明显关联（P＜0.001，P=0.002，P=0.005，P＜0.001，图2）。

2.3 胶质瘤中H3K27M、Ki-67表达的相关性

应用Spearman秩相关分析显示，H3K27M、Ki-67蛋白表达在胶质瘤组织中具有相关性（r=0.376，P=0.02，表2）。

图1 H3K27M、Ki-67免疫组织化学结果（免疫组化一步法×100）

图2 Kaplan-Meier法分析病理分级、肿瘤部位、H3K27M阳性表达、Ki-67高标记指数与患儿生存时间相关性

表2 H3K27M、Ki-67蛋白高标记指数在脑胶质瘤组织中的表达例

3 讨论

颅内胶质瘤是脑肿瘤中发病率最高且预后最差的肿瘤，可起源于神经胶质、室管膜、脉络丛上皮等，依据其所在部位及病理类型不同，病程时间不一。本组38例无WHOⅢ级胶质瘤，可能因本组小儿脑胶质瘤病例数量相对较少的缘故。脑胶质瘤可发生于颞叶、额叶、松果体区、基底节区、脑干等部位，本组病例中发生于脑干21.1%。H3K27M蛋白属于组蛋白类型，有多种变体，分为5种亚基，分别为H1、H2A、H2B、H3和H4，H3K27M 组蛋白H3.3 特定位点的突变导致编码氨基酸的改变，该机制与中线胶质瘤的发生密切相关[9-11]。Hochart 等[12]研究发现儿童中线结构胶质瘤中，H3K27M突变与患儿的预后具有显著的相关性。采用手术切除肿瘤组织后予以放化疗等传统治疗方式治疗伴H3K27M 突变的弥漫性中线胶质瘤患儿，预后较差，2年生存率低于10%。目前主要采取检测脑脊液中肿瘤细胞DNA组蛋白H3.3的基因突变情况对疗效进行评估[13-14]。

本研究同样发现高级别胶质瘤组中的H3K27M蛋白阳性表达率明显高于低级别胶质瘤组，生存时间中位数明显偏低，且H3K27M在正常脑组织中未见表达，在38例人胶质瘤中13例阳性表达，阳性表达率为34.2%，差异有统计学意义，说明H3K27M蛋白能在一定程度上反映小儿胶质瘤病变程度。Ki-67细胞在G0期不表达，进入G1期开始表达，在M期表达最强，能反映细胞核增殖活性[15]。Bai 等[16]报道Ki-67在正常脑组织中不表达，在胶质瘤细胞中异常高表达，且Ki-67标记指数与恶性程度呈正相关。本研究结果也表明Ki-67蛋白表达水平随胶质瘤病理分级的增高而显著增高，且Ki-67在正常脑组织中未见表达，在38例人胶质瘤中38例阳性表达，阳性表达率为100%，差异有统计学意义，说明Ki-67的表达与胶质瘤的发生、发展有关，Ki-67高标记指数是预后不良的标志。Spearman 相关性分析显示在本组病例中H3K27M、Ki-67 在小儿脑胶质瘤表达具有相关性，结合相关文献推测可能有以下原因：1）H3K27M突变致瘤性主要涉及组蛋白去甲基化修饰；2）Ki-67是由MKI67 基因编码的一种核蛋白抗原，主要反映肿瘤增殖率，两者在胶质瘤起源中可能涉及相同的调控机制，有待进一步研究证实。

目前胶质瘤的治疗方法多主张手术及术后辅助放化疗，但效果仍不理想，一些新的治疗方式正在研究中。张作鑫等[17]使用RNAi 技术在胶质母细胞瘤细胞系中敲低PLK4表达后，发现肿瘤细胞的体外增殖能力明显减弱。化疗治疗对小儿胶质瘤仍具有重要意义，将替莫唑胺与生物靶向药物联用是近年研究热点之一[18]。本研究考虑到化疗过程中仍有血液、神经毒性等不良反应发生，对小儿发育可能有不利影响，仅7例患儿进行了术后化疗，化疗方案包括环磷酰胺+依托泊苷+顺铂、顺铂+依托泊苷、长春新碱+卡铂、替莫唑胺等，但是化疗组与非化疗组之间患儿的生存率无显著性差异，可能与病例数相对较少、缺乏规范化疗有关，仍需扩大病例样本进一步研究。

综上，本研究对小儿脑胶质瘤中H3K27M、Ki-67的表达进行研究并分析其与胶质瘤的病理分级、预后的关联，表明小儿脑胶质瘤中H3K27M、Ki-67的表达水平对小儿脑胶质瘤的病理分级、预后具有提示意义，且H3K27M、Ki-67蛋白表达在胶质瘤组织中具有相关性，为研究胶质瘤的发生发展及靶向治疗提供了线索。综合本研究及文献报道提示，下一步将进一步研究H3K27M的甲基化状态是否与神经干细胞的多能性调节有关、胶质瘤组织中TGF-β1表达水平是否影响Ki-67的表达水平从而影响胶质瘤的良恶性程度、运用RNAi 技术能否阻断Ki-67 基因在胶质瘤中的表达等，期望能减轻胶质瘤患儿的痛苦，减少其家庭和社会的负担。