长链非编码RNA AGAP2-AS1通过YAP通路影响结肠癌细胞的生物学行为*

结肠癌是最常见的恶性肿瘤，在全球已成为肿瘤相关死亡的第三大原因[1]。当前主要的治疗策略包括手术、化疗和放疗。然而大多数患者通常会因发生远处转移而导致生存率较低。因此，特异性生物标志物和治疗靶点研究对于早期诊断、治疗和生存率的提高具有十分重要的意义[2]。

长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸且不具有或仅有部分编码功能的RNA分子。越来越多的研究证实lncRNAs 在许多生理病理过程中起着至关重要的作用[3]，如lncRNAs异常表达与肿瘤发生发展密切相关。大量研究显示lncRNAs可以调节肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭和耐药等恶性生物学行为，进而在肿瘤发生发展中扮演癌基因或抑癌基因的角色[3-4]。结肠癌发生发展与lncRNAs的异常表达也同样密切相关。近期研究表明，lncRNA 参与Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）转录活性的调控在肿瘤发生发展中发挥重要作用，研究者证实lncRNA B4GALT1-AS1通过调控RNA结合蛋白HuR 增强YAP 转录活性，进而促进骨肉瘤细胞的干性增加和迁移能力。有研究证明，YAP激活诱导结肠癌的发生和转移[5-6]。同时，YAP激活入核后参与多种癌基因的转录调节，其中包括肿瘤细胞侵袭转移，及重要的基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）MMP2、MMP9表达的调控。AGAP2-AS1是定位于染色体12q14.1的反义lncRNA，已有研究报道在多种肿瘤中表达失调，并且与多种恶性肿瘤的生物学行为密切相关[7-8]。过表达AGAP2-AS1可诱导非小细胞肺癌细胞侵袭转移，并且AGAP2-AS1表达与预后呈正相关[7]。同样的，AGAP2-AS1 也诱导胃癌细胞增殖和侵袭[9]。然而，AGAP2-AS1 在结肠癌中的表达以及在YAP信号通路中的作用机制尚不清楚。因此，本文就此问题进行深入研究。

1 材料和方法

1.1 临床资料

通过美国TCGA数据库下载结肠癌患者的RNASeq数据，包括457例结肠癌和42例健康正常样本。同时获得AGAP2-AS1 在结肠中的表达数据。收集于2018年1月至2019年3月在义乌市中心医院就诊且通过病理科确诊的结肠癌组织和癌旁组织20例。患者术前未进行化疗和放疗，所有标本获取均取得患者及其家属同意，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 人结肠癌细胞系（SW480、HCT-116细胞）和人结肠黏膜上皮细胞（NCM460）购自中国科学院细胞库（上海）。所有细胞用含有10%胎牛血清（FBS，Gibco）的Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）在37℃、5%CO2维持。特异性靶向AGAP2-AS1（si-AGAP2-AS1）和阴性对照siRNA（si-negative control，si-NC）（中国GenePharma 公司）使用Lipofectamine 3000 Reagents（美国Invitrogen 公司）将这些质粒转染到HCT-116细胞系中。pcDNA3.1-AGAP2-AS1和阴性对照pcDNA3.1（中国GenePharma公司）使用Lipofectamine 3000 Reagents将这些质粒转染到SW480 细胞系中，之后pcDNA3.1-AGAP2-AS1和si-YAP 在上述相同条件下进行共转染，并且每次转染6h后更换培养液。

1.2.2 CCK-8法测定细胞增殖能力 通过CCK-8试剂盒评估不同组细胞增殖率。将HCT-116细胞（密度为1×104个细胞/孔）接种到96孔板中，各组细胞经相应处理后继续培养0、24、48、72 h，分别加入10%CCK-8溶液。然后，将10 μL CCK-8溶液加入每个孔中，将细胞在37℃、5%CO2下再培养1～2 h。最后，使用分光光度计测量450 nm处的吸光度以代表细胞增殖能力。

1.2.3 克隆形成实验 将转染的细胞（密度为1×102个细胞/孔）细胞接种在6 孔板中。在恒温培养箱中培养2 周后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 液冲洗3次每次10 min，使用0.1%结晶紫染色菌落。每个实验重复3次。

1.2.4 细胞划痕实验 通过细胞划痕实验评估结肠癌细胞的迁移能力变化。将si-AGAP2-AS1或si-NC转染的细胞在六孔培养皿中培养至80%～90%汇合。通过无菌移液管将线性伤口轨迹稳定地划在细胞表面上。用PBS液冲洗培养皿以除去多余的细胞，然后加入相应的无血清培养基。通过测量闭合尺寸评估0和24 h细胞的迁移情况。最后，通过倒置光学显微镜（Leica）拍摄划痕间隙的改道。每个实验重复3次。

1.2.5 细胞迁移实验 通过Transwell 评估结肠癌细胞的迁移能力。首先将转染的细胞接种在Transwell（不含基质胶）上室内，在下室中添加血清培养基。然后在37℃温育24 h后，用4%多聚甲醛固定侵入的细胞20 min，用0.1%结晶紫染色20 min。最后在倒置显微镜下观察并计数。每个实验重复3次。

1.2.6 流式细胞术 使用膜联蛋白V/FITC凋亡检测试剂盒（美国BD Biosciences公司），通过流式细胞术分析测量细胞凋亡。将细胞分别放入6孔板中，并培养48 h。随后，使用PBS液洗涤并重悬细胞。接着使用膜联蛋白V-FITC和PI在室温下（避光）染色细胞15 min。用流式细胞仪（美国BD cantoⅡ公司）检查细胞群。

1.2.7 实时荧光定量PCR 根据说明书的实验步骤，使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）来提取总RNA。首先，使用SuperScript Ⅳ逆转录酶（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行逆转录以合成cDNA后，在Applied Biosystems 7500实时PCR系统（美国ABI公司）上使用PrimeScript RT Master Mix（大连Takara公司）进行PCR测定。所有实验重复3次，并采用择2-ΔΔCt方法分析AGAP2-AS1相对表达水平。用18S rRNA作为mRNA的内部参考。引物序列为AGAP2-AS1，5′-TACCTTGAC CTTGCTGCTCTC-3′（正向）和5‘-TGTCCCTTAA-TGA CCCCATCC-3′（反向）；18S rRNA，5′-CTTAATTTGACTC AACACGGGA-3′（正向）和5′-AGCTATCAATCTGTCA ATCCTGT-3′（反向）。

1.2.8 蛋白质印迹 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白质。通过12%的SDS-PAGE分离目标蛋白质并转移到PVDF膜上。随后在室温下用TBST缓冲液（含5%胎牛血清）封闭膜2 h，并在4℃下与一抗孵育过夜。兔YAP、兔p-YAP抗体（美国CST，1:1 000），兔MMP2、兔MMP9（美国ABclonal，1:1 000）。然后，将膜与山羊抗兔二抗（英国Abcam，1:5 000）在37℃下孵育2 h。使用ChemiDoc TM 成像系统（美国Bio-Rad Laboratories）分析目标条带。β-actin（美国CST，1:1 000）作为内参对照。

1.2.9 免疫荧光共聚焦 免疫荧光实验，首先将细胞在6孔板中培养生长24 h，并在室温下用5%多聚甲醛固定20 min，然后在室温下用0.5%Triton X-100 透膜20 min，并用5%BSA在室温下封闭40min。接着将它们与兔YAP（美国CST，1:100）在4℃温育过夜。加热1 h后，将样品用PBS液洗涤3次，并与特异性山羊抗兔二抗FITC（美国ABclonal，1:100）在37℃下孵育1.5 h。用PBS液洗涤3次后，在室温下用DAPI染色细胞核5 min。使用共聚焦显微镜（日本Nikon A1r公司）观察免疫荧光。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。所有检测数据以记录。通过t检验评估组间的差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AGAP2-AS1在结肠癌组织和细胞中显著上调

研究结果显示，在与TCGA数据库中42例正常组织AGAP2-AS1（2.28±0.13）相比，457例结肠癌组织中AGAP2-AS1表达（5.34±0.17）显著上调（P＜0.05，图1A）。实时荧光定量PCR检测20例结肠癌和癌旁组织，显示结肠癌组织中AGAP2-AS1（3.42±0.22）相比较于癌旁组织（1.57±0.18）（P＜0.05，图1B）表达显著上调。SW480、HCT-116和NCM460细胞中AGAP2-AS1表达结果表明AGAP2-AS1 在结肠癌细胞中表达也显著上调，其中SW480和HCT-116分别上调约2倍和3.7倍（P＜0.05，图1C）。本研究分析TCGA数据库中AGAP2-AS1表达水平与肿瘤临床病理参数的关系，结果显示M0组AGAP2-AS（272.7±13.42）表达水平与M1组AGAP2-AS1（432.4±34.17）相比，M1组AGAP2-AS1显著上调，证实高表达AGAP2-AS1组与肿瘤远处转移密切相关（P＜0.05，图1D）。

图1 AGAP2-AS1在TCGA数据库、结肠癌组织和SW480、HCT-116和NCM460细胞系中的表达

2.2 AGAP2-AS1表达调控结肠癌细胞增殖和凋亡

分别在HCT-116和SW480构建AGAP2-AS1敲低（相较于对照组，AGAP2-AS1表达0.45±0.04）和过表达（相较于对照组，AGAP2-AS1表达23.3±0.18）体系（P＜0.05，图2A），通过CCK8 实验检测si-AGAP2-AS1组增殖能力显著抑制，pcDNA3.1-AGAP2-AS1组增殖能力显著增加。流式凋亡实验显示，si-AGAP2-AS1组凋亡显著增加，pcDNA3.1-AGAP2-AS1组凋亡显著减少。细胞克隆显示si-AGAP2-AS1 组细胞克隆增殖能力显著降低，pcDNA3.1-AGAP2-AS1 组克隆增殖能力显著增加（P＜0.05，图2B～D）。

图2 AGAP2-AS1对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

2.3 AGAP2-AS1表达诱导结肠癌细胞迁移

细胞划痕实验显示，si-AGAP2-AS1组细胞划痕愈合率（48.34±4.53）显著低于NC组（69.12±6.25），pcDNA3.1-AGAP2-AS1组细胞划痕愈合率（70.28±6.41）显著高于NC组（45.02±6.73）（P＜0.05，图3A，B）。细胞迁移实验显示，相比于NC组，si-AGAP2-AS1组细胞迁移能力显著下调，定量结果显示si-AGAP2-AS1组迁移细胞数目为（112.41±10.53），NC组为（43.52±9.45）。pcDNA3.1-AGAP2-AS1组细胞迁移能力显著上调，定量结果显示pcDNA3.1-AGAP2-AS1组迁移细胞数目为（83.52±8.08），NC组为（33.68±4.56）（P＜0.05，图3C，D）。

2.4 AGAP2-AS1表达影响结肠癌YAP通路活性

YAP 异常表达和定位与肿瘤的发生、发展密切相关，可引起结肠癌细胞增殖、侵袭、转移及凋亡一系列恶性生物学行为。通过Western blot 检测si-AGAP2-AS1结肠癌细胞YAP、p-YAP的表达，结果显示与NC组相比，si-AGAP2-AS1 组p-YAP表达水平显著增加1.46倍（P＜0.05，图4A），通过免疫荧光共聚焦发现si-AGAP2-AS1抑制YAP核转移（白色箭头指示YAP 具体定位）（图4B）。通过Western blot 检测MMP2、MMP9的表达。结果显示si-AGAP2-AS1 组MMP2、MMP9表达分别下调约1.5倍和1.4倍（P＜0.05，图4A）。为进一步明确AGAP2-AS1通过诱导结肠癌YAP通路调控MMP2、MMP9的表达，本研究共转染pcDNA3.1-AGAP2-AS1和si-YAP。Western blot 检测YAP、p-YAP、MMP2和MMP9的表达，结果显示si-YAP 后抑制AGAP2-AS1 对MMP2、MMP9表达的调控，其中MMP2、MMP9分别下调约1.5倍和2倍（P＜0.05，图4C）。结果表明，AGAP2-AS1可以通过激活YAP通路影响MMP2、MMP9的表达，从而诱导结肠癌细胞转移。

图3 AGAP2-AS1对结肠癌细胞迁移的影响（×200）

图4 AGAP2-AS1对结肠癌细胞YAP通路的调控

3 讨论

近年来，肠癌的发生发展的病理机制备受关注[1-2，10]。探索lncRNAs对结肠癌发生发展的影响以及新的作用机制对于肿瘤的诊断、治疗和预后至关重要。既往研究证实，多种lncRNAs在结肠癌中异常表达并且诱导结肠癌的发生发展[11-12]。如lncRNA CCAT2在结肠癌中过表达，可促进肿瘤生长、转移[12]。lncRNA ZDHHC8P1可以通过靶向调控miR-34a促进结肠癌的进展和转移[13]。lncRNA AFAP1-AS1过表达与预后不良相关，并且在结肠癌中发挥致癌作用[14]。

AGAP2-AS1 在多种肿瘤中已被广泛研究报道[15-16]。研究者发现AGAP2-AS1可通过抑制肿瘤抑制因子LATS2和KLF2转录充当致癌基因，促进非小细胞肺癌进展[8]。在胶质母细胞瘤的研究中，研究者发现AGAP2-AS1可以通过直接结合EZH2和LSD1，进而抑制TFPI2的表达发挥致癌特性[17]。然而AGAP2-AS1在结肠癌中的表达及其对结肠癌发生发展的潜在作用机制鲜有报道。为此，本研究首先于TCGA数据库和结肠癌组织中证实AGAP2-AS1表达显著上调。随后通过实时荧光定量PCR在结肠癌细胞再次验证了AGAP2-AS1的表达。在干扰或者上调AGAP2-AS1表达后，通过CCK8试剂盒、流式细胞技术、细胞克隆实验、细胞划痕和迁移实验等观察到AGAP2-AS1 在结肠癌组织和细胞中表达上调，并且AGAP2-AS1显著诱导结肠癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为。

作为肿瘤侵袭转移的关键机制，肿瘤细胞YAP通路的异常活化参与多种癌症细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性生物学行为，包括结肠癌等[18-19]。正常情况下YAP通常以磷酸化形式存在于细胞质中，当YAP通路活化时会导致磷酸化YAP减少从而诱导YAP入核增加，参与基因转录的调控[20]。越来越多研究显示，YAP入核后参与众多癌基因的转录调节，其中包括EMT相关蛋白、Bcl2、MMPs等表达的调控，在肿瘤的恶性生物学进展中发挥至关重要的作用[20-22]。多种因素如低氧[23]等均可以激活结肠癌中的YAP通路，并且诱导结肠癌恶性生物学行为。有研究报道了lncRNAs也能够参与肿瘤YAP通路的调控过程[10，17]。研究证实lncRNA UCA1激活YAP通路从而促进胰腺癌细胞迁移和侵袭，并且证实UCA1有望作为预后不良的生物标志物和胰腺癌的新治疗靶点[21]。当前AGAP2-AS1调控结肠癌YAP通路的研究尚未见报道。本研究首先在AGAP2-AS1敲低HCT-116细胞，检测到p-YAP表达水平增加，MMP2、MMP9表达水平降低。同时通过免疫荧光共定位实验证实YAP在AGAP2-AS1敲除的HCT-116细胞中核转移显著降低。通过共转染pcDNA3.1-AGAP2-AS1和si-YAP，证实AGAP2-AS1高表达激活YAP通路并且通过YAP通路激活诱导MMP2、MMP9的表达。这与结肠癌发生发展中YAP通路的激活和MMP2、MMP9高表达相关研究一致[24]。

综上所述，本研究证实AGAP2-AS1 在结肠癌组织和细胞中高表达和肿瘤的恶性生物学行为密切相关，并且AGAP2-AS1诱导YAP通路活化上调MMP2、MMP9的表达可能参与细胞恶性生物学行为的调控。因此，AGAP2-AS1 有望成为结肠癌预后判断的一个新型生物标志物，进一步探究AGAP2-AS1 调控结肠癌增殖、迁移、转移的具体机制，对于结肠癌的早期诊断和治疗方案的确定具有显著的指导意义。