拓扑异构酶Ⅱα在粤东地区乳腺癌中的表达及其临床意义

刘丽娟，张永渠，2，张丽莹，魏晓龙

（1.汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺中心，广东 汕头 515041；2.厦门大学医学院抗癌研究中心，福建 厦门 361102；3.汕头大学医学院附属肿瘤医院病理科，广东 汕头 515041）

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是女性因癌症死亡的首位原因[1]。化疗在乳腺癌的治疗中占有重要的地位，但目前尚无预测化疗药物敏感性的可靠指标。蒽环类药物在乳腺癌辅助及姑息治疗中具有明显的优势[2]。有研究报道，乳腺癌患者能否从蒽环类药物的治疗中获益与拓扑异构酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TopoⅡα）基因的改变有关[3-4]。TopoⅡα基因位于染色体17q12-q21，是ATP依赖的对细胞起关键作用的水解酶和合成酶，在细胞DNA复制和转录过程中维持染色体的空间结构，具有重要的作用，可能参与调控癌症细胞的凋亡和增殖。TopoⅡα是DNA复制的关键酶，也是包括蒽环类在内的各种细胞毒性药物的治疗靶点之一[5]，因此，大多数研究集中在其对蒽环类药物疗效的潜在预测价值[3，6-7]。TopoⅡα在粤东地区的乳腺癌患者的表达情况及其临床意义尚未见报道。本研究旨在通过免疫组化技术检测粤东地区乳腺癌患者TopoⅡα的表达，分析其与乳腺癌临床病理特征的关系，并通过开放数据库Kaplan-Meier plotter分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2015—2016年于汕头大学医学院附属肿瘤医院就诊的乳腺癌患者术后石蜡包埋组织424例，均经病理确诊为乳腺癌，术前未行任何治疗。本研究获患者知情同意，并经汕头大学医学院附属肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂

TopoⅡα、雌激素受体 （estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人类表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、Ki-67等抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 所有标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片4 μm厚，再经Roche Ventana全自动免疫组化仪检测TopoⅡα、ER、PR、HER2、Ki-67等标志物。免疫组化检测按照说明书操作。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，已知的阳性组织作为阳性对照。

1.3.2 结果判读 显微镜下评估染色的情况。TopoⅡα为核染色，染色细胞数＜25%为Ⅰ级，25%～50%为Ⅱ级，50%～75%为Ⅲ级，＞75%为Ⅳ级。ER、PR为核染色，染色细胞数＞1%为阳性。HER2细胞膜染色，Ki-67为核着色，染色细胞数＞14%为阳性，≤14%为阴性。

1.3.3 分析TopoⅡα基因的表达与乳腺癌患者预后的相关性 利用开放数据库Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast）分析TopoⅡα基因的表达与乳腺癌患者预后的相关性。

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义，均采用双侧检验。

2 结果

2.1 TopoⅡα的表达与乳腺癌临床病理的关系

TopoⅡα在乳腺癌细胞的核中表达（图1），Ⅰ级约占56.8%，Ⅱ级约占33.3%，Ⅲ级约占6.4%，Ⅳ级约占3.5%。由表1可见，TopoⅡα的表达与乳腺癌患者的年龄、T分期、淋巴结是否转移无相关性（P＞0.05）；与组织学分级呈正相关，组织学分级越高，TopoⅡα分级越高（P＜0.001）。ER或PR受体表达情况与TopoⅡα的分级呈负相关，ER或PR受体阴性，其TopoⅡα的分级越高（P＜0.001）。HER2阳性乳腺癌患者的TopoⅡα分级比HER2阴性患者的高（P=0.028）。Ki-67低表达患者，其TopoⅡα分级较低；Ki-67高表达患者，其TopoⅡα分级较高（P＜0.001）。

表1 TopoⅡα表达与乳腺癌临床病理特征的关系 ［例（%）］

2.2 TopoⅡα表达与乳腺癌分子分型的关系

管腔A和管腔B型乳腺癌TopoⅡα多数为Ⅰ～Ⅱ级，HER2过表达型和三阴性型乳腺癌TopoⅡαⅡ～Ⅳ级的比例更高，4种分子分型乳腺癌TopoⅡα的表达差异有统计学意义（P＜0.01，表2）。

表2 TopoⅡα在不同分子分型乳腺癌的表达情况 ［例（%）］

2.3 TopoⅡα基因与乳腺癌预后关系

TopoⅡα基因的表达与乳腺癌患者预后的相关性分析表明，TopoⅡα基因的表达与乳腺癌患者的无复发生存率（HR=2.00，P＜0.001）和总生存率（HR=1.84，P＜0.001）均有相关性，乳腺癌患者TopoⅡα基因表达越高，其无复发生存率和总生存率越低，见图2、3。但HER2过表达型乳腺癌患者TopoⅡα基因的表达与无复发生存率（HR=1.32，P=0.15）和总生存率（HR=1.6，P=0.16）均无相关性，三阴性乳腺癌TopoⅡα基因的表达与总生存率（HR=0.90，P=0.66）无相关性。

3 讨论

本研究结果显示，ER阴性、PR阴性及HER2阳性的乳腺癌患者的TopoⅡα分级更高（P＜0.05），而组织学级别与TopoⅡα分级呈正相关（P＜0.001），这与An等[8]的研究结论一致，但杨迪等[9]报道TopoⅡα mRNA与雌激素受体的表达无相关性，这可能是该研究检测的是TopoⅡα的mRNA水平，而本研究是通过免疫组化检测TopoⅡα的蛋白水平表达情况。细胞增殖反映恶性肿瘤的发生及进展，Ki-67在恶性肿瘤中的高表达常提示预后较差，我们发现在Ki-67阳性患者中，TopoⅡα分级明显高于Ki-67阴性患者（P＜0.001）。

图2 TopoⅡα基因表达对乳腺癌患者无复发生存率的影响

图3 TopoⅡα基因表达对乳腺癌患者总生存率的影响

2011年Goldhirsch等[10]提出的乳腺癌分子分型是目前乳腺癌治疗的重要指南，但不同的研究结果显示TopoⅡα的表达与乳腺癌分子分型的相关性存在差异。本研究结果提示TopoⅡα高表达（Ⅱ～Ⅳ级）患者中，三阴性比例最高（77.2%），其次是HER2过表达型（55.2%），管腔A型最少（1.6%），与杨良全等[11]的研究结果相似。通过Kaplan-Meier plotter数据库检索分析发现TopoⅡα基因高表达的乳腺癌患者的无复发生存率低，在管腔A型、管腔B型及三阴性乳腺癌中均提示类似结果，但是在HER2过表达型患者中差异无统计学意义；此外，TopoⅡα基因表达高的乳腺癌总人群的总生存率更低，在管腔A、管腔B均提示类似结果，而在三阴性乳腺癌和HER2过表达型乳腺癌中TopoⅡα的表达差异并不能有效预测乳腺癌患者的总生存率。但Shigematsu等[12]报道，在HER2过表达型乳腺癌患者中，TopoⅡα基因高表达可能提示更好的预后，这可能与TopoⅡα阳性阈值的界定不同或者不同国家和地区乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表达情况不同有关[8]。

综上所述，在粤东地区乳腺癌中，TopoⅡα高表达与乳腺癌高增殖能力及高组织学级别呈正相关，HER2过表达型及三阴性乳腺癌TopoⅡα的Ⅱ～Ⅳ级比例更高，TopoⅡα高表达常提示不良预后。TopoⅡα表达情况可能对乳腺癌患者个体化治疗方案的选择具有一定的指导意义，但能否作为一个独立的乳腺癌预后指标，仍需更多的循证医学证据进一步证实。