复明片治疗青光眼的活性成分及可能作用靶点的网络药理学研究

黄丹梅，陈一村

（汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

青光眼被中医称为内障病，中药治疗青光眼自古即有。中医临床认为，内障病主要致病原因是肝气受损、脏器不和。复明片为补益类中成药，有滋补肝肾，养阴生津，清肝明目之功效。主治肝肾阴虚所致的羞明畏光、视物模糊。研究证实复明片能有效改善青光眼患者高眼压及视神经损伤等症状，复明片水溶液给家兔滴眼可明显缩小瞳孔直径，降低眼内压[1-2]。复方中药作用特点是多成分、多靶点、多途径，普通中药作用机制研究仍沿用西药“一药物、一基因、一疾病”模式，这种研究方法对中药的作用机制仅是以管窥天，只见一端。网络药理学是基于系统生物学与多向药理学理论，采用计算机模拟技术及高通量组学分析，对药物作用机制进行挖掘分析的新学科[3]。本研究利用网络药理学探讨复明片治疗青光眼的活性成分和可能作用靶点。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；STRING数据库11.0（https://string-db.org）；PDB数据库（https://www.rcsb.org）；AutoDockTools 1.5.6（http://autodock.scripps.edu/resources/adt）；AutoDock Vina 1.1.2（http://vina.scripps.edu）；Cytoscape 3.3.0（https://cytoscape.org/）；PyMOL 1.7（http://pymol.org）。

1.2 复明片活性成分的筛选

利用TCMSP数据库检索复明片的中草药化学成分，将口服利用度＜30%的和药物相似性＜0.18的成分剔除[4-5]。采用ChemBioDraw Ultra 12.0软件绘制化合物的结构，然后用ChemBio3D Ultra 12.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行优化，输出mol2格式结构，再通过AutoDockTools 1.5.6软件转变为pdbqt格式。

1.3 活性成分及治疗靶点的选择

利用TCMSP数据库搜索青光眼（glaucoma）疾病的治疗靶点。将青光眼的治疗靶点导入STRING数据库中，限定研究物种为“Homo Sapiens”，获得蛋白互作关系，并通过该网站得到相应PDB蛋白晶体模型的链接。再从PDB数据库下载具有蛋白质—配体复合物的晶体模型，通过AutoDockTools1.5.6软件及其附带的激动剂化合物确定作用位点的三维坐标。无相应的PDB蛋白晶体的靶点则通过瑞士生物信息研究所网站（http://www.hpc-ch.org/sib/）进行同源性建模[6]。

1.4 分子对接模拟试验

采用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接研究。三维坐标参数“exhaustiveness”设置为8。对接结果选取打分值最高的构象[7-10]。选取与网络药理作用的核心蛋白对接分数最高的几个化合物，用软件PyMOL 1.7绘图。

1.5 复明片活性成分—靶点的网络构建

STRING数据库得到的靶点互作关系与分子对接模拟试验得到的蛋白靶标作用的复明片活性成分一起用Cytoscape 3.3.0软件构建复明片活性成分—靶点互作网络关系图。并通过Cytoscape软件的“Network Analyzer”工具分析网络各点的作用关系，同时获得网络药理作用的核心蛋白。

2 结果

2.1 复明片总方分子数据库的建立

通过TCMSP数据库共检索到复明片的化学成分1109个，其中山茱萸226个、车前子55个、夏枯草60个、决明子68个、人参190个、枸杞子188个、菟丝子29个、女贞子119个、黄连48个、谷精草24个、木通43个、地黄76个、泽泻46个、茯苓34个、牡丹皮55个、槟榔52个。筛选后得到183个活性化学成分，山茱萸20个、车前子9个、夏枯草11个、决明子14个、人参22个、枸杞子45个、菟丝子12个、女贞子13个、黄连14个、谷精草8个、木通8个、地黄2个、泽泻2个、茯苓15个、牡丹皮11个、槟榔8个，其中交集化合物39个。

2.2 复明片活性成分—靶点网络

STRING数据库获得的靶点关系（表1）及靶点对接后的数据用Cytoscape合并构建复明片活性成分—靶点网络图（图1）。图中共191个节点，963条边，其中红色的点代表蛋白，绿色的点代表药物，边则代表蛋白或药物彼此的作用关系，节点的大小表示其受其他点作用的多少。图1中碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白节点明显大于其他蛋白。

表1 青光眼靶点蛋白

2.3 分子对接结果

利用AutoDock Vina 1.1.2软件对筛选出的活性化合物和靶点进行分子对接，以蛋白附带的原配体作为对接结果的标尺，发现复明片中活性成分与碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白结合的亲和力大于原配体（表2），表明碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白与复明片中活性成分有较好的结合活性。对接情况见图2～图4。

图1 复明片活性成分—靶点网络

表2 分子对接结果

图2 碳酸酐酶Ⅰ对接图

图3 碳酸酐酶Ⅱ对接图

图4 碳酸酐酶Ⅳ对接图

3 讨论

本研究通过构建复明片活性成分—靶点网络，发现碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白节点明显大于其他蛋白，提示这3个蛋白可能是复明片治疗青光眼的关键靶点。碳酸酐酶是一种含锌金属酶，哺乳动物体内已发现13种碳酸酐酶同工酶和3种碳酸酐酶相关蛋白，它们的结构、分布和性质各异，多与各种上皮细胞分泌H+和碳酸氢盐有关[11]。目前用于青光眼治疗的药物，主要有β受体阻断剂、α受体激动剂、M胆碱受体激动剂、前列腺素衍生物、碳酸酐酶抑制剂及其复合制剂。而其中碳酸酐酶抑制剂主要针对睫状体上的碳酸酐酶Ⅱ受体。本研究中碳酸酐酶Ⅱ分布在睫状体中，碳酸酐酶Ⅳ分布在视网膜和视网膜上皮中，而碳酸酐酶Ⅰ的分布未有提及，但均有催化CO2和H2O生成H+和HCO3-，调节电解质平衡的作用。碳酸酐酶在上皮细胞中催化CO2和H2O生成H+和HCO3-，透过腔膜分泌于房水中。由于房水中的液体要保持电中性，Na+向房水分泌增加，同时带动Cl-向房水移动，从而使房水形成高渗压，于是促进H2O向房水流动，保持房水平衡和正常的pH值，而青光眼患者由于房水回流不畅，引起眼压升高[12-13]。而本研究分子对接结果显示复明片的有效成分均对碳酸酐酶的3种同工酶均具有较强的结合能，据此我们猜测复明片降低眼内压的原因可能因为药物成分抑制碳酸酐酶而减少眼内碳酸氢盐的形成，从而使房水的产生减少，导致眼内压降低。通过血管进入后房的阳离子主要是Na+，当HCO3-与Na+结合形成NaHCO3时，房水渗透压升高，从而吸收水分使房水生成增加。如果抑制了碳酸酐酶的活性，使H2CO3生成减少，也就使HCO3-生成减少，即可导致房水生成减少，眼压降低[14]。

综上所述，本研究结果表明碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ可能是复明片治疗青光眼的关键靶点。分子对接模拟试验也验证了预测的活性成分和靶点具有较好的结合活性，说明本研究的预测具有一定的可靠性，可以为进一步研究复明片治疗青光眼提供新的参考方向。