巨噬细胞移动抑制因子在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制

吴跃斌，黄漫枝，蔡文锋，汪 彬，石刚刚

（汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤，是指心肌组织经过一段时间的缺血后，血流重新恢复正常，造成组织损伤的程度较缺血时加重、器官功能持续恶化的现象。心肌I/R损伤的主要机制包括ROS的产生[1]、细胞内钙超载[2]、pH值的改变[3]、炎症反应[4]、能量供应不足[5]等。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一个多向性趋化促炎因子，在机体中分布广泛，参与包括动脉粥样硬化、败血病、类风湿性关节炎、脑损伤、肺损伤和肝脏的缺血等多种疾病[6]。多年来对MIF在心肌I/R中的作用报道不一致，有认为MIF主要是致炎因子，通过炎症介导损伤[7-8]。有些认为MIF主要通过调节AMPK通路激活能量代谢起到保护作用[9]。我们在前期实验中发现心肌细胞在缺氧再复氧（hypoxia reoxygenation，H/R）过程中，MIF的表达呈现“先高后低”的现象。在细胞H/R早期，MIF抗体能使炎症因子产生减少，损伤减轻，重组MIF使炎症因子增多，损伤加重；在细胞H/R晚期，MIF抗体能抑制AMPK磷酸化，损伤加重，重组MIF能激活AMPK磷酸化，损伤减轻。所以MIF早期表达升高主要起到介导炎症的作用，MIF晚期表达过低导致能量供应不足，说明MIF表达过高或过低都可以加重心肌细胞H/R损伤，表明MIF在H/R的不同时间段，发挥不同的作用，在心肌细胞H/R过程中维持MIF表达相对恒定是非常重要的。为此，我们利用正常小鼠和敲除MIF基因小鼠建立心肌I/R模型，观察MIF异常表达在心肌I/R损伤中扮演的角色，并验证与离体心肌细胞H/R损伤的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型C57BL/6Cnc小鼠，SPF级，8～12周龄，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。MIF基因敲除C57BL/6Cnc小鼠由上海南方模式生物科技发展有限公司构建，本课题组自己繁殖鉴定。

1.1.2 主要试剂和仪器 戊巴比妥钠购自德国Merck公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK-MB）ELISA试剂盒购自四川新健康成生物股份有限公司；MIF抗体、CD11b抗体购自英国Abcam公司；MIF抑制剂ISO-1、AICAR购自美国MCE公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；Vevo LAZR小动物多模成像系统（加拿大Fujifilm VisualSonics公司）；TBA-40FR全自动生化分析仪（日本Toshiba公司）；Spectra Max M2多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌I/R模型的建立及给药 小鼠禁食12 h后称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠（60 mg/kg），待小鼠麻醉至四肢无剧烈反应时，固定于手术台，用脱毛膏脱去胸部的毛。将气管插入小鼠呼吸道，气管连接呼吸机，呼吸机参数：呼吸频率115，呼吸比1.3∶1.0，潮气量2.0。于左侧胸口开胸，用镊子钝性分离胸大肌和胸小肌，在第3和第4肋骨之间分离肋间肌，撕开心包膜，暴露出心脏；用8-0尼龙线结扎左前降支冠状动脉，位置在左心耳下2～3 mm处，此时心电图可见ST段明显抬高，心脏的心尖能看到发白；缺血时间到后，剪开结扎线，心电图ST段回落，心脏恢复供血，心尖重新恢复红色，表明心肌I/R模型建立成功。逐层缝合肋间、胸小肌、胸大肌和皮肤。给药：二甲基亚砜（DMSO）、ISO-1（30 mg/kg）、AICAR（700 mg/kg）于缺血45 min后再灌注3 h（I45 min/R3 h）时腹腔注射给药。

1.2.2 实验分组 采用随机数字表法随机分组。（1）野生型C57BL/6Cnc小鼠随机分成5组：假手术组（sham组）、缺血15、30、45、60 min组（I15 min组、I30 min组、I45 min组、I60 min组），每组各6只。（2）野生型C57BL/6Cnc小鼠随机分成6组：sham组、缺血45 min再灌注0.5、2、3、4、5 h组（I45 min/R0.5 h组、I45 min/R2 h组、I45 min/R3 h组、I45 min/R4 h组、I45 min/R5 h组），每组各6只。（3）野生型C57BL/6Cnc小鼠随机分成5组：sham组、I45 min/R4 h组、DMSO组、ISO-1组、AICAR组，每组各6只。（4）野生型C57BL/6Cnc和MIF基因敲除型C57BL/6Cnc小鼠随机各分为2组：sham组、I45 min/R0.5 h组。

1.2.3 蛋白质印迹法检测MIF蛋白的表达水平 提取小鼠心肌组织蛋白，按100 mg/mL加入裂解液，用乳化分散仪分散4次，每次10 s。于冰上放置30 min，每10 min振荡1次。12 000 r/min，4℃，离心15 min，取上清，按4∶1加入5×上样缓冲液，煮沸5 min变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（50 V）至分离胶后，更换100 V电压继续电泳约1 h，15 V半干转75 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次。二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。滴加发光液，于暗室用X光胶片曝光。

1.2.4 Vevo LAZR小动物多模成像系统检测心功能 将小鼠胸部毛用脱毛膏脱干净，采用2.5%（体积分数）异氟烷气体诱导麻醉，1.0%（体积分数）异氟烷气体维持麻醉，将小鼠固定在小动物多模成像恒温操作台上操作，用MS-400超声探头在胸骨旁短轴切面分别采集M-Mode和B-Mode图像。由图像数据分析可得左心室射血分数和短轴缩短率。

1.2.5 免疫荧光法观察组织切片CD11b的表达 在心肌组织乳头肌位置横切制作冰冻切片，厚度4 μm，切片后4℃于4%多聚甲醛中固定15 min，用PBS洗涤5 min，重复3次，用免疫荧光封闭液室温封闭1 h，滴加50 μL CD11b抗体（用1∶50封闭液稀释），于4℃孵育过夜。复温30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加50 μL Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（用1∶1000二抗稀释液稀释）。以下步骤都需避光，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAPI染核5 min，PBS洗涤5 min，滴加抗荧光猝灭封片液，盖玻片封片，于荧光显微镜下观察结果。

1.2.6 二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）染色法观察组织切片ROS的表达 在心肌组织乳头肌位置横切制作冰冻切片，厚度为4 μm，将DHE原液用PBS稀释3 000倍，每个玻片滴加50 μL稀释后的DHE，37℃孵育30 min。PBS冲洗终止染色，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察染色结果。

1.2.7 ELISA试剂盒检测小鼠血清LDH、CK、CK-MB的活性 检测CK时小鼠血清用生理盐水稀释64倍；检测LDH、CK-MB时，小鼠血清用生理盐水稀释16倍。每个样吸取100 μL于检测管，用TBA-40FR全自动生化分析仪测定。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行统计分析。正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠心肌I/R时MIF蛋白表达的时效变化

与sham组相比，I15、I30、I45、I60 min组MIF蛋白的表达都上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），且在I45 min时表达最高，图1A。因此选择I45 min为缺血时间进行心肌I/R造模。与sham组相比I45 min/R0.5 h、I45 min/R 2 h、I45 min/R 3 h MIF的蛋白表达都有所上调，在I45 min/R 2 h时达到最高，I45 min/R 3h时出现下调的趋势。与sham组相比I 45min/R 4h、I45 min/R5 h MIF的表达都下调，并且I45 min/4 h最低，图1B。所以选择I45 min/R0.5 h作为造模的短时间点，I45 min/4 h作为造模的长时间点。

图1 小鼠心肌MIF蛋白表达的时效变化

2.2 MIF在小鼠心肌短时间I/R损伤中的作用

2.2.1MIF基因敲除能改善小鼠短时间I/R的心功能损伤 与sham组比，野生型小鼠I45 min/R0.5 h后，射血分数、短轴缩短率均明显降低（P＜0.05）。与野生型小鼠比较，MIF基因敲除小鼠在I45 min/R0.5 h后，心功能得到明显的改善，差异有统计学意义（P＜0.05），图2。

图2 MIF基因敲除改善小鼠短时间I/R的心功能损伤

2.2.2MIF基因敲除能减少小鼠短时间I/R的炎症细胞聚集 与sham组比，野生型小鼠I45 min/R0.5 h后，使用CD11b标记的炎症细胞明显增多，而MIF基因敲除小鼠在I45 min/R0.5 h后，炎症细胞明显减少，图3。表明MIF基因敲除能减少炎症细胞，改善心肌短时间I/R带来的炎症损伤。

2.3 MIF在小鼠心肌长时间I/R损伤中的作用

2.3.1 MIF抑制剂增加长时间I/R血清酶的漏出，AMPK激动剂减少酶的漏出 与sham组比较，小鼠在长时间I/R后，LDH、CK-MB、CK的漏出明显增多（P＜0.05）。在I45 min/R3 h时注射ISO-1能增加心肌酶的漏出，而注射AICAR却能减少心肌酶的漏出，图4。

2.3.2 MIF抑制剂加重心肌长时间I/R心功能损伤，AMPK激动剂改善心功能损伤 与sham组比较，小鼠在心肌长时间I/R后，心功能指标射血分数、短轴缩短率明显减低（P＜0.05）。在I45 min/R3 h时注射ISO-1能加大射血分数、短轴缩短率的降低程度，而注射AICAR能改善心肌长时间I/R带来的心功能损伤（图5）。

图3 MIF基因敲除减少小鼠短时间I/R时炎症细胞聚集（×400）

图4 ISO-1和AICAR对小鼠心肌长时间I/R损伤时血清酶漏出的影响

图5 ISO-1和AICAR对小鼠长时间I/R损伤时心功能的影响

2.3.3 MIF抑制剂增加心肌长时间I/R时ROS的产生，AMPK激动剂减少ROS的产生 与sham组比较，小鼠在长时间I/R后，ROS的产生明显增多（P＜0.05）。在I45 min/R3 h时注射ISO-1能增加ROS的产生，而注射AICAR能减少长时间心肌I/R导致的ROS的产生增加，图6。

图6 ISO-1和AICAR对小鼠长时间I/R损伤时ROS的影响（×200）

3 讨论

MIF作为一种致炎因子，在心肌I/R中发挥着重要的角色[10-11]，而近年来报道突出了MIF在心肌I/R过程中的抗自由基[12]、抗凋亡[13]、保护自噬功能[14]和促进能量产生[15]等作用。我们前期在细胞水平缺氧再复氧实验中，即在原代心肌细胞、微血管内皮细胞以及H9c2心肌细胞株进行H/R造模，发现在H/R过程中，MIF的表达呈现一个“先高后低”的现象。在心肌I/R中，MIF主要与炎症反应和能量代谢密切相关，早期MIF的高表达不会影响能量代谢不足，显然是参与激活炎症而加重了I/R损伤。后期低表达，显然与炎症反应关系不大，主要是影响能量代谢，进一步加重损伤。因此，维持MIF平衡对于改善心肌I/R损伤非常重要。

MIF在后期表达水平低于缺血前，在此基础上，注射MIF抑制剂，损伤进一步加重。众所周知，MIF是调控AMPK的关键因子，在能量摄取和代谢方面起着重要作用，实验中也发现AMPK激动剂能明显改善损伤。在以后的工作中我们将采用MIF激动剂或重组MIF直接观察AMPK的变化，进一步阐明MIF在心肌I/R过程中通过调控AMPK维持能量代谢的重要性。

综上所述，本研究从整体水平上说明了MIF在心肌I/R中所扮演的角色，为MIF成为干预心肌I/R损伤潜在靶点提供了有力的理论支持。