丝素蛋白//壳聚糖//羟基磷灰石膜具有好的生物相容性及促成骨性能

全君杰，罗 刚，李志容，梁二妹

1珠海市香洲区香湾社区卫生服务中心口腔科，广东 珠海 519000；2广州医科大学附属口腔医院，广东 广州510120

引导骨再生技术在口腔颌面骨缺损中已广泛运用，屏障膜材料在引导骨再生技术上具有关键作用，临床上已有在使用的各类生物膜材料，但各有物化性能不佳、引导骨再生能力不足及细胞粘附不佳等缺点，丝素蛋白（SF）和壳聚糖（CS）均是天然高分子材料，有较多研究表明SF和CS具有良好的引导骨再生的能力［1-3］。有研究将SF做成三维多孔SF支架用于骨组织工程研究［4］，先将骨髓间充质干细胞植入支架，再植入鼠头盖骨创伤模型上，说明SF可用于骨重建和再生，表现出机械稳定性和持久性。然而，单纯的SF支架还有很多缺点，如其机械性能不佳，成形困难，亲水性差和降解缓慢等。载有生长因子的CS膜可以明显促进骨的再生［5-6］。由CS制成的单纯CS生物材料在运用时，具有机械性能较差，在中性溶液中状态不稳定等缺陷，就需要将CS进行修饰或者与其它材料复合以改善性能［7］，构建有骨诱导性的骨组织工程材料。HA晶体是构成人体自然骨的重要组成部分［8］，SF∕羟基磷灰石（nHA）材料的构建有效地改善了nHA的机械强度，在诱导骨再生方面也有一定效果［9-10］。将CS与nHA复合，构建适合骨组织工程的生物材料，这种复合材料有一定的韧性和可塑性，并有一定诱导骨再生能力［11-12］。但是上述复合材料还存在力学强度低，降解速率与机体组织在其表面的生长速率不匹配等问题。目前，鲜有研究将以上3种材料符合制备生物膜来研究3种材料复合后对于促进成骨细胞生长的影响，本研究运用SF，CS和HA制备复合生物膜，将MG-63细胞与复合生物膜在体外共同培养，以了解其成骨性能。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器

SF粉末（浙江湖州新天丝生物技术有限公司），平均粒径2.5 μm；CS（脱乙酰度＞90%），HA（上海博奥生物科技有限公司），乙醇、醋酸等均为分析纯。CCK-8检测试剂盒，硝基苯磷酸盐试剂（Sigma，美国）。

1.2 复合生物膜的制备

将SF和CS溶于1%（v/v）醋酸配成酸性溶液，调pH至5.0。配置1 mol的硝酸钙溶液和0.6 mol的磷酸氢二铵溶液，将HA逐滴加入溶液中（单纯的SF/CS复合膜不加入HA），反应温度控制在4℃，pH控制在6.0。搅拌反应2 h后，复合材料浆料在室温下放置至少4 h除去气泡，浇铸在平板上成膜，室温下挥发溶剂48 h,用去离子水反复洗涤，即得到SF/CS/n-HA及单纯的SF/CS复合膜，复合膜铺在平板上干燥备用。

1.3 复合生物膜的电镜检测

取适量的膜材料置于电子显微镜载物台上，真空下喷金，观察期表面形态。

1.4.1 实验分组 以冷沉淀法制备2组复合膜，实验组采用SF/CS/n-HA膜，对照组采用SF/CS膜，空白组使用载玻片。

1.4.2 实验材料的准备 将实验组和对照组的复合膜裁切制备成边长1 cm，厚度0.5 cm的正方形片，空白组使用市售载玻片裁切成边长为1 cm的正方形，以60Co消毒灭菌备用。

1.4.3 细胞接种 将3组材料置于无菌培养皿中，加入75%酒精溶液消毒处理30 min，PBS缓冲液(pH 7.4)充分浸泡1 h，中间换液以保证交换出所有残留酒精。然后置于紫外灯下照射30 min，自然风干。灭菌后的材料用DMEM培养液(20%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)浸泡24 h，移入12孔无菌培养板。取500 μL人骨肉瘤细胞（MG63）细胞悬液(1.0×105/mL)接种于含试样的培养板中，在37℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中培养，再于每孔加入1 mL DMEM培养液,培养板置于37℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱内培养，次日换液，以后隔日换液1次。

1.4 复合生物膜的细胞实验

1.4.4细胞粘附率的测定 分别在细胞接种培养1、4、7 h后，将试样从培养液中取出，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗2次，去除死细胞，移入96孔板，每孔加入新鲜培养基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管轻轻吹打数次，培养板置于37℃恒温箱培养2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶标仪内于波长490 nm处测量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.5 细胞粘附率的测定 分别在细胞接种培养1、3、5 d后，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗2次，以去除死细胞，移入96孔板，每孔加入新鲜培养基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管轻轻吹打数次，培养板置于37℃恒温箱培养2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶标仪内于波长490 nm处测量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.6 碱性磷酸酶(ALP)活性测试 将接种培养7、14、21 d后的试样从培养液中取出，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗2次，加入700 μL消化液消化3～5 min，用吸管轻轻吹打数次。再加入含血清培养基终止消化，充分挤出支架中液体后，离心收集细胞。以PBS缓冲液（pH 7.4）漂洗细胞，再加入200 μLTritonX-100(2%)细胞裂解液，置于4℃冰箱裂解24 h。取裂解液100 μL加入96孔板，避光滴加配置好的磷酸对硝基苯酯每孔200 μL于恒温培养箱培育30 min后取出，用酶标仪测定细胞裂解液在405 nm处的光密度A405nm值。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，对数据行析因方差分析，对每个时间段进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜结果

两组复合生物膜中，SF/CS/nHA与SF/CS生物膜的均有孔隙结构，而SF/CS/nHA的孔隙直径略大于SF/CS，其孔隙分布情况也较为均匀（图1）。

2.2 细胞黏附率

结果显示，3组的MG-63细胞黏附率均随着接种时间增加而增高，各组间的差异均具有统计学意义（P＜0.05，表1）；实验组及对照组在3个时间段内，均高于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验组的细胞黏附率在各个时间段内也均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 3组3个时间点MG63细胞的黏附比较Tab.1 The absorbance values of cell adhesion at three time points of three groups(Mean±SD)

2.3 细胞增殖情况

3组细胞的增殖率随时间的增加而增加，在3个时间段内，实验组及对照组均高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05，表2）。第3天实验组的细胞增殖率高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；第1天和第5天，实验组与对照组的细胞增殖率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 3组3个时间点MG63细胞的增殖情况比较Tab.2 Comparison of proliferation rate of MG-63 on different membranes at three time points of three groups(Mean±SD)

2.4 复合膜上MG-63细胞的ALP活性

结果显示，MG-63细胞产生的ALP会随着时间的增加而增加。在3个时间段内，实验组及对照组的ALP均高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05，表3）；实验组的ALP也均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 3组3个时间点MG63细胞的ALP活性比较Tab.3 Comparision of alkaline phosphatase activity of MG-63 cells at different membranes(Mean±SD)

3 讨论

在临床上已有部分成品生物膜材料运用在骨缺损及骨引导再生修复上，理想的生物膜材料应该具有与软组织接触面能起到阻挡纤维细胞长入骨缺损处形成瘢痕愈合，与骨组织面接触的生物膜面应该具有能引导成骨细胞长入骨缺损及生物膜上，并在一定程度上能促进骨组织的再生［13-14］。国内外有较多文章对SF、CS及HA进行研究，这3种材料对于成骨细胞均具有一定引导其增殖及诱导其成骨性能，但是少有研究对于这3种材料进行复合，并进行体外细胞实验来研究其引导骨再生的性能。

细胞的黏附率是细胞在一个介质上生长及增殖的第一步，有研究发现间充质干细胞可以通过胶原模拟多肽（DGEA和PA）和Ⅰ型胶原蛋白粘附于HA上，并促进了成骨标志物的表达［15］，他们认为通过模拟多肽和Ⅰ型胶原蛋白不仅促进了成骨细胞对于HA的粘附，而且还促进了成骨细胞的分化，以达到HA的骨整合作用。本研究也发现MG-63细胞在实验组的黏附率及增殖率均高于对照组及空白组，在黏附率实验中，实验组的细胞黏附率高于对照组及空白组。可能是HA的加入诱导了MG-63细胞加速粘附在了实验组中［16］，实验组级对照组均高于空白组，所以无论是SF/CS膜还是SF/CS/nHA膜均具有较为安全的生物相容性。

有研究发现在聚乙二醇水凝胶中加入nHA，其中加入1%质量比的nHA，成骨细胞的增殖率明显高于其他组，成骨标志物的沉积以及Ⅰ型胶原蛋白也均高于其他组［17］。该研究认为nHA的加入可以有效促进成骨细胞的增殖分化以及促进成骨。本研究的增殖率的实验中，在第1天和第5天，实验组的细胞增殖率并未显示出与对照组有统计学差异，我们认为其原因可能是MG-63细胞在第1天粘附于生物膜上未进入高速的增殖期［18］，而在第5天未显示出差异，可能是因为细胞的接触抑制产生的影响［19］；在第3天时出现实验组比对照组及空白组的增殖率都高，可能是因为nHA的加入，诱导了MG-63细胞的增殖［20-21］。此外，有研究将nHA加入聚醚酮支架，nHA的加入提高了支架材料的粗糙度及亲水性能［22］，该复合支架能够有效促进成骨细胞的粘附，增殖以及成骨标志物的表达，认为nHA的加入大大提高了材料的生物活性，提高支架的粗糙度和亲水性能有利于细胞的粘附与增殖。本研究认为nHA的加入能够提高膜材料的孔径，有利于细胞的粘附及增殖［23］。

ALP的表达是被认为成骨细胞在体外分化成熟成骨细胞及矿化基质的重要标志［24-25］，有研究发现，以HA涂层制备的羟基磷灰石-聚酰胺66支架与成骨细胞共同培养，相较于未用HA涂层的支架，HA无论是在成骨分化的早期和晚期，都能够提高成骨相关蛋白（COL1、RUNX2和OCN）的表达，提高了ALP的活性［26］。该结果认为在支架中加入HA可以促进成骨相关蛋白的表达，促进了成骨细胞的分化，这与本研究结果一致。实验组及对照组的ALP表达在3个时间段内均高于空白组，表明SF和CS能引导MG-63的ALP表达［27-28］；而实验组的ALP表达也是明显高于对照组，可能是实验组加入了HA的原因，HA是人体自然骨的组成部分，其具有一定的骨引导性，能够促进成骨相关蛋白的表达，可以诱导MG-63细胞的ALP表达［29］。

综上所述，SF/CS/nHA具有良好的生物相容性及具有一定的骨引导性，能够诱导成骨细胞的粘附，增殖及促进其成骨。在后续研究中，我们将进行该生物膜的动物实验，以期该生物膜能成为一种新型的生物膜材料。