柠檬醛抑制真菌作用的研究进展及其在食品防霉中的应用前景

张晶晶，彭锐，杜春贵，滑亚婷，黄秋丽，姚潇翎

(浙江农林大学 工程学院，杭州 311300)

食品安全问题已经是一个全世界都关注的问题，其中真菌及其产生的次级代谢物真菌毒素引起的食品安全问题日益严重[1]。据报道，每年约有10亿吨农业产品受到真菌及真菌毒素的污染[2]，导致了资源和经济的损失，而且由于真菌毒素极强的急性毒性、致畸性、致癌性、致突变性等，将会对人类的身体健康和生命安全造成严重威胁[3]。因此，亟待大力研发防霉剂，解决真菌霉变问题。目前，国内外研发的食品防霉剂大多为化学药剂，虽然防霉效果好，但由于化学抗菌剂的安全性受到挑战，天然抗菌物凭借着具有化学合成剂无法比拟的安全优势，越来越被推崇[4-6]。因此，研发新型环保防霉剂取代化学防霉剂将成为必然。

近年来，由于植物源性防霉剂具有抑菌活性强、抑菌谱广、对环境友好、对人体相对安全等优点，逐渐成为植物性天然抗菌剂研究的热点，其中，关注较多的是一些具有较强抗菌防霉活性的中草药。作为中药山苍子精油主要成分的柠檬醛，因具有较强的抑菌性能[7]，目前正在引起学者的研究兴趣。且我国的中药山苍子精油产量居世界第一，故研制柠檬醛类抗菌剂，来源广、成本低、绿色、安全，必将有着广阔的研发与应用前景。为此，本文综述了近年来国内外有关柠檬醛抑菌性能、抑菌机理等的研究进展，并对其在食品霉菌防治中的应用前景进行了展望，可为柠檬醛在食品领域中的抗菌防霉研究与应用提供参考依据。

1 柠檬醛对青霉菌的抑制作用

青霉菌是青霉属真菌的一种，极易侵染柑橘等物质导致其霉变腐烂[8]。目前，有少量柠檬醛对青霉菌抑制的相关研究报道。

1.1 柠檬醛对青霉菌细胞形态的影响

Tao等[9,10]通过对柑桔精油和柠檬醛对意大利青霉和指状青霉的抗真菌活性以及抗真菌作用机制进行了研究，发现柠檬醛可以通过引起细胞质的丢失，以及菌丝的变形而明显改变意大利青霉菌菌丝的形态。柠檬醛对意大利青霉形态影响的扫描电镜(SEM)见图1。

图1 柠檬醛对意大利青霉菌丝体形态的影响Fig.1 Effect of citral on the morphology of Penicillium italicum mycelium

由图1可知，未经柠檬醛处理的对照菌的菌丝正常、管状、规则、均质(见图1中 a)。经柠檬醛最小抑菌浓度(MIC)处理4 d后，意大利青霉菌的菌丝表面呈疣状(见图1中b)。而经柠檬醛最小杀菌浓度(MFC)处理4 d后，意大利青霉菌的菌丝因缺乏细胞质出现严重塌陷(见图1中c和d)，且菌丝萎缩变形(见图1中c)。

为了进一步阐明柠檬醛的杀伤机制，Tao采用透射电镜(TEM)对经MIC和MFC处理的青霉细胞超微结构的影响进行了分析，结果见图2。

图2 柠檬醛对意大利青霉细胞超微结构的影响Fig.2 Effect of citral on cellular ultrastructure of Penicillium italicum

由图2可知，未经柠檬醛处理的意大利青霉菌的细胞表面光滑致密(见图2中a)，而经柠檬醛处理后的意大利青霉菌的细胞形态发生明显变化 (见图2中b和c)。其中，柠檬醛MIC明显诱导了菌丝抑制的形成(见图2中b)，而柠檬醛MFC则破坏了细胞壁和细胞膜，导致细胞质丢失，大量物质从细胞壁外挤压而出(见图2中c)。

1.2 柠檬醛对青霉菌细胞膜及细胞内成分的影响

陶能国等[11,12]研究表明柠檬醛处理可导致细胞总MDA和H2O2增加(见图3)，细胞内物质泄漏，细胞的总脂质和麦角甾醇含量降低(见图4)，从而诱导青霉菌丝体发生严重的膜脂过氧化损伤，增加细胞膜通透性，破坏细胞膜结构，达到抑制青霉菌生长的作用。

图3 柠檬醛对指状青霉总MDA和H2O2含量的影响Fig.3 Effect of citral on the total MDA and H2O2 content of Penicillium digitatum

图4 柠檬醛对意大利青霉细胞总脂质含量(a)和麦角甾醇含量(b)的影响Fig.4 Effect of citral on the total lipid content (a) and ergosterol content (b) of Penicillium italicum cells

同时陶能国、欧阳秋丽等[13]的研究表明，柠檬醛既能破坏青霉菌细胞膜，又会影响青霉菌的一些代谢途径，从而使细胞不能进行正常生命活动。柠檬醛对青霉菌起破坏作用的方式主要有：(1)柠檬醛能通过大量积累活性氧破坏指状霉菌的氧化磷酸化和细胞膜，抑制指状霉菌的生长；(2)通过破坏指状青霉线粒体外膜和内膜，改变其选择通透性，从而影响线粒体内外物质的输送；(3)通过降低呼吸代谢对氧的利用率，从而使 ATP 含量减少；(4)通过直接影响糖酵解途径(如改变指状青霉糖酵解途径关键酶的活性，见图5)、重要中间产物的含量和TCA途径。

图5 柠檬醛对指状青霉丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)活性的影响Fig.5 Effect of citral on PK，PFK，HK activity of Penicillium digitatum

综上所述，柠檬醛处理青霉菌后，不仅改变了青霉菌菌丝形态、细胞微观结构，而且破坏了细胞膜完整性、细胞膜通透性以及细胞代谢途径，从而起到抑菌作用。

2 柠檬醛对曲霉菌的抑制作用

曲霉菌是广泛存在于自然界中的一种深部条件致病性丝状真菌[14]。有的能产生对人体有害的真菌毒素，有的则引起水果、蔬菜、粮食霉腐。因此，国内外学者对利用防霉剂杀死曲霉菌进行了大量研究，其中有部分柠檬醛作为杀菌剂的相关研究报道。

2.1 柠檬醛对曲霉菌细胞形态的影响

研究表明[15-17]用柠檬醛处理曲霉后，曲霉会发生以下变化：菌丝扭曲、欲折、分枝少；分生孢子梗萎缩，表面光滑；细胞体积减小，表面凹陷，细胞壁厚度减小，细胞壁、细胞膜、胞浆的缺损和疏松，线粒体解体，不规则线粒体数量增多并聚集等。

罗曼等[18]采用柠檬醛蒸汽与溶液对黄曲霉孢子进行处理，并通过透射电镜观察了黄曲霉孢子的显微结构变化。柠檬醛蒸汽对黄曲霉孢子超微结构的影响见图6。

图6 黄曲霉孢子经柠檬醛同分异构体蒸汽处理后透射电镜下的微观结构Fig.6 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer steam treatment under TEM

由图6可知，孢子细胞壁形态变化不明显，细胞浆内物质聚集明显。与对照组比较，处理组细胞壁变薄且凹凸不平，部分区域皱缩；但周质空间(细胞质膜与细胞之间的空隙)的电子密度没有明显改变。此外，处理组胞浆内物质也明显不如对照组的分布均匀，有区域化聚集趋势。柠檬醛溶液处理对黄曲霉孢子超微结构的影响见图7。

图7 黄曲霉孢子经柠檬醛同分异构体溶液处理后透射电镜下的微观结构Fig.7 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer solution treatment under TEM

由图7可知，与对照组相比，经过柠檬醛溶液处理的实验组细胞壁严重皱缩并多处突起；周质空间的电子密度大大增强，细胞膜清晰且在部分区域出现与胞质分离现象；细胞内出现明显的固缩化，出现不规则的固形物。

2.2 柠檬醛对曲霉菌细胞膜及细胞内成分的影响

研究表明柠檬醛处理曲霉能改变其膜的物理参数(见表1)[19]，进而改变其质膜的分子结构。蒋立科等[20]研究了柠檬醛作用于曲霉的动静态过程，发现该醛能使黄曲霉中的有些大分子失去正常结构，改变其功能，影响相关的调节机制，进而杀死曲霉。

表1 受损黑曲霉质膜的粘弹性参数Table 1 The viscoelasticity parameters of damaged Aspergillus niger plasmalemma

吴子健等[21]研究表明柠檬醛处理会破坏曲霉氧化还原系统和细胞能量代谢途径，如可以通过降低黄曲霉细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的活力(见表2和表3)影响曲霉的TCA循环，从而进一步影响细胞能量代谢途径。

表2 柠檬醛对SDH活力的影响Table 2 The effect of citral on SDH activity

表3 柠檬醛对胞液内 MDH 活力的影响(以 NADP+为辅酶)Table 3 The effect of citral on MDH activity in cytosol (with NADP+ as coenzyme)

也有研究表明柠檬醛会使细胞内Ca2+、K+、Mg2+渗漏量增加，总脂质含量下降，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸增加，并影响曲霉菌的DNA、RNA和蛋白质的合成，见表4。

表4 柠檬醛对曲霉菌3种同位素标记前体掺入抑制率Table 4 Inhibition rate of citral on three isotope labeled precursors of Aspergillus

综上所述，柠檬醛处理曲霉菌后，不仅改变了曲霉菌菌丝形态、细胞形态、细胞微观结构，而且破坏了细胞膜完整性、细胞膜通透性、膜的物理参数以及细胞代谢途径，从而起到抑制曲霉的作用。

3 柠檬醛对木霉菌的抑制作用

木霉菌是食用菌生产中一个主要的竞争性杂菌和病原菌[22]，不仅会导致食用菌已灭菌培养料或发酵料受到污染，而且感染双孢蘑菇、平菇等菌丝体，引起菌袋或菌棒中菌丝体凋亡，造成极为严重的经济损失[23-25]。目前，有少量柠檬醛对木霉菌抑制作用的研究报道。

林群英等[26]对4种植物精油抑制黑曲霉、产黄青霉、绿色木霉和木霉等病原真菌的效果进行分析，并以金针菇为材料进行初步保鲜效果评价。研究结果显示：柠檬醛对产黄青霉及木霉的抑制率最高。郭丹等[27]通过对山苍子油主成分柠檬醛、香茅醛及其衍生物共 10种化合物对绿色木霉抑制活性进行分析，结果显示这些化合物对绿色木霉有一定的抑制作用。而且经化合物处理后，菌液相对渗透率均有所增大，说明上述化合物造成菌体细胞膜的破坏是其抑菌作用原因之一。

4 柠檬醛对其他真菌的抑制作用

目前，有关柠檬醛对真菌抑制作用的研究，主要集中在上述3种真菌上。除此之外，还有少数有关犬白色念珠菌、白假丝酵母等真菌的研究。

孙博等[28]对肉桂醛、柠檬醛在真菌黏附口腔黏膜上皮以及对犬白色念珠菌超微结构的影响进行探索。结果表明，药物处理后白色念珠菌黏附率显著下降，而且细胞表面粗糙、皱缩、萎陷、外膜空洞、胞浆内容物流出、细胞壁增厚、质壁分离、梁青等[29]研究发现山苍子油具有优良的抗白假丝酵母活性，且白假丝酵母在芽痕处对山苍子油比较敏感，高浓度的精油(5.0 μL/mL)对细胞产生不可逆破坏；而且山苍子油杀菌的靶标可能是细胞壁和细胞外膜，使细胞内大分子外泄，细胞器变形，最终导致细胞死亡。

5 柠檬醛在食品防霉中的应用前景

目前，柠檬醛抑制真菌作用的研究取得了一定成果，但其研究主要集中在对体外真菌的抑制效果和少量抑菌机理等方面，有关柠檬醛的应用研究，特别是在食品中的防霉研究与应用仍然较少，柠檬醛抑菌机理的研究仍有待加强。展望未来，柠檬醛将在食品领域的防霉研究与应用中具有广阔的发展前景。

5.1 粮食防霉

粮食在储藏过程中，受温湿度、含水量等因素影响，极易产生霉变。真菌是粮食霉变的关键“杀手”，如灰绿曲霉、黄曲霉、青霉等[30]。据联合国粮农组织估算， 每年大约有5%～7%的粮食、饲料等农作物产品受霉菌污染，所造成的经济损失可达数千亿美元。而且霉菌产生的毒素会使人与动物中毒，威胁人类身体健康，尤其黄曲霉毒素危害最为严重[31]，因此，采取措施解决粮食霉变问题至关重要。而现在防止粮食霉变的解决措施主要有物理方法和添加化学药剂法。但物理防霉见效慢、效果差，而化学药品例如磷化铝、芳香烃、有机酸类等的使用会带来很多副作用，如：化学毒性残留、环境二次污染、真菌产生抗药性，这些给粮食的安全储藏带来了潜在威肋[32]。因此，开发安全、高效、绿色的天然粮食防霉剂取代化学防霉剂成为必然趋势，而柠檬醛作为一种天然抗菌剂，必将在粮食的防霉中发挥重要作用。

5.2 果蔬防霉

据相关统计，现阶段我国新鲜果蔬的腐烂损耗率在 30%～50%之间，远远落后于发达国家平均损耗率7%的水平[33]。造成果蔬腐烂的主要原因是真菌的感染，影响果蔬的食用价值、感官价值及经济价值，甚至对人体健康及环境安全产生影响。因此，解决果蔬霉变问题十分重要。长期以来人们多采用低温、气调、减压等处理方法配合化学药剂或者香料涂膜来防治，而化学药剂的使用不仅会导致病原菌产生抗药性，而且会增加果蔬农药残留量，危害人类健康[34,35]。相比之下，植物源防霉剂在人体消化道内可降解，不影响消化道菌群和药用抗菌素的使用[36]，而且安全无毒，具有一定的生理活性。因此，柠檬醛防霉剂的研究与开发对促进果蔬产业持续发展具有重要意义。

续 表

5.3 食用菌防霉

在食用菌栽培过程中，经常发生霉菌污染，霉菌大多数能够降解和吸收纤维素，从而影响食用菌的产量，进而增加食用菌的生产成本[37]。因此，有效抑制霉菌生长是食用菌栽培成功的重要因素。所以，为了抑制霉菌污染，在栽培中往往需要在生料拌料时加入抑菌剂，如多菌灵、克霉灵、代森锰锌等化学药剂，但这些化学抑菌剂会造成环境污染、农药残留和增加抗药性，不利于食用菌的菌丝生长，影响食用菌的品质和产业化发展，同时增加成本[38,39]。因此，需要寻找更加安全、高效且成本低的新型抑菌剂来解决这些问题。而柠檬醛类抗菌剂抑菌谱广、来源足、成本低、绿色、安全，将会为食用菌栽培过程中的防霉环节做出突出贡献。