正交法优化超声波辅助山楂红色素提取工艺研究

王钊，张本尚，王贝贝，刘树博，杨明成，邹建*

(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046；2.河南省科学院同位素研究所有限责任公司，郑州 450015)

视觉，往往是影响消费者购买食品的首要因素，色泽艳丽美观的食品更易受到人们的青睐[1]，因此，食用色素被广泛用于食品的感官改善和品质提升[2]。在各类色彩中，红色具有增强食欲和刺激购买欲的特性[3]，深受人们的喜爱。当前食用红色素主要可分为人工合成红色素和天然红色素两大类[4]。其中，合成红色素虽然色彩饱满、性质稳定、廉价易得[5]；但同时也存在营养价值较低，增加身体脏器负担[6]，具有潜在的致癌、致畸、致突变作用，导致儿童智力发育迟缓，行为性情过激[7]等安全问题。因此，天然红色素的开发成为食用红色素的重要研究方向。

随着人们对于天然红色素研究的不断深入，除着色外，天然红色素的保健功能(抗菌消炎、降低血脂等)也受到了人们的重视[8,9]。例如，红枣色素为类黄酮类色素，除着色外，还具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病、降三高等药效作用，可应用于抗癌、抗氧化等保健产品[10]。

在研究过程中，山楂红色素引起了人们的兴趣。山楂在我国分布广泛、产品丰富，河南省是山楂的主要产区之一。新鲜山楂又称红果，富含多种营养成分，是我国的传统美食之一，可直接食用并有益于人体健康[11]。新鲜山楂经酿造后可获得兼具鲜艳红色外观、酸甜口味、营养丰富等优点的山楂醋[12]，是时下广受好评的美味保健类天然饮品。山楂干粉碎可入药，具有助消化、降低血脂血压、防止血管粥样硬化、抗菌消炎、止痛止血等功效[13]。山楂红色素提取自山楂，含有可溶性糖、酸类和黄酮类物质，属于天然花青素类色素，具有防癌抗癌、保护大脑、保肝护肾等多重保健功效[14,15]。此外，研究表明山楂红色素具有良好的抗氧化和着色能力，同时能够从保鲜和美化两方面提升产品品质，并常常用于食品的风味调和。例如，使用山楂红色素代替胭脂红素添加在健胃消食咀嚼片中，既可利用其酸度促进消化，又可以很好地改善消食咀嚼片的外观颜色[16]。又如，富含山楂红色素的玫瑰软糖，色泽红润，味道醇美，还具有抗疲劳、抗氧化和降血脂等作用[17]。此外，富含山楂红色素的菊花、洛神花复合果酱色泽紫红艳丽，口感细腻，酸甜适中，又兼具保健功能。迄今为止，山楂红色素已广泛用于果汁、果酱、果醋饮品和糕点甜品等多种食品产品中，增色增味，提升品质。

鉴于山楂红色素的优秀品质，本文拟通过有机溶剂提取法对山楂红色素进行提取，并优化其工艺条件。在参考相关提取工艺方案后[18,19]，引入超声波辅助提取手段，并通过正交实验法对各单因素提取条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

新鲜山楂：购于郑州市大学路丹尼斯超市；无水乙醇(分析纯)：天津富宇精细化工有限公司。

1.2 实验仪器

HWCL-3型集热式恒温磁力搅拌浴 郑州长城科工贸有限公司；Hei-VAP Precision HL型旋转蒸发仪 德国海道夫(Heidolph)仪器公司；KQ5200E型超声波清洗器 昆明市超声仪器有限公司；FA3204B型电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FreeZone型真空冷冻干燥仪 美国LABCONCO仪器公司。

1.3 实验步骤

1.3.1 山楂的预处理

由于鲜山楂富含多种营养成分和色素，直接于空气中进行切片、粉碎等操作会发生氧化作用而影响其品质；并且鲜山楂水分较多，直接处理会导致有效成分的大量流失，对实验结果造成不利影响，故而需对鲜山楂进行干燥处理。虽然烘干等高温处理方式具有良好的干燥效果，但在加热过程中将不可避免地对山楂红色素及其他成分产生不利影响，因此，本文采取冷冻干燥法，根据文献报道的方法对山楂进行处理[20]。将干燥好的山楂粉碎，过筛，密封，置于干燥器中备用。

1.3.2 最大吸收波长的确定

称取1.0 g山楂粉末，加入50 mL浓度为95%的乙醇溶液浸泡20 min，超声波处理40 min，在50 ℃条件下加热回流50 min，过滤后定容稀释，用95%乙醇溶液做参比溶液，利用紫外可见分光光度计全波段扫描，按照文献报道[21]，在200～700 nm波长范围内确定最大吸收波长值。

1.3.3 单因素实验条件设计

分别设置乙醇浓度(50%、55%、60%、65%、70%)、料液比(1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85)、提取温度(30，40，50，60 ℃)、超声时间(20，30，40 min)、提取时间(30，40，50，60，70，80，90 min)5个单因素，在排除对提取效率影响最小的因素后，保持余下4个单因素条件中的3个因素不变，探究另一个因素变化对提取山楂红色素的影响，在此基础上进一步对单因素条件进行优化，直至达到最优水平。

1.3.4 正交实验设计

通过对单因素实验结果的分析，在其基础上选择乙醇浓度、料液比、超声时间、提取时间4个因素中的较优水平，选用L9(34)正交实验水平表，设计正交实验，进一步优化提取山楂红色素的工艺条件。

1.3.5 平行重复验证实验

在正交实验得出的最佳提取条件下重复三次提取，对正交实验的结果进行验证，分析验证实验的结果。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

色素溶液用95%乙醇稀释后，在波长200～700 nm范围内出现了最大吸收波长(见图1)，其最大吸收波长峰值在291 nm处，因此后续单因素实验的吸光度值测定波长均为291 nm。

图1 山楂红色素最大吸收波长的确定Fig.1 Determination of maximum absorption wavelength of hawthorn red pigment

2.2 单因素条件对提取效果的影响

2.2.1 乙醇浓度变化对提取效果的影响

称取5份1.0 g的山楂粉末，分别量取不同浓度的乙醇溶液(50%、55%、60%、65%、70%)，保持料液比1∶60、超声时间40 min、提取温度50 ℃、提取时间50 min不变，过滤后定容，在291 nm波长下分别测定不同浓度乙醇提取液的吸光度值，结果见图2中(a)。

(a)

由图2中(a)可知，当乙醇浓度增大时，提取效率随之增大，乙醇浓度为65%时为最大值；此后继续增大乙醇浓度时溶液的吸光度值有所下降(70%)。因此以乙醇浓度65%为中心，对其两侧的乙醇浓度进行筛选，进行精确定位乙醇浓度的实验，实验结果见图2中(b)，当乙醇浓度以63%-65%-67%的比例递增时，测得的吸光度值依然以65%时最大，因此选择65%为最佳乙醇浓度条件。

(b)

2.2.2 不同料液比对色素提取的影响

称取5份1.0 g的甜椒粉，分别按照料液比1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85的比例准确量取65%的乙醇溶液，经超声处理后(40 min)，在50 ℃油浴中恒温提取50 min，过滤后定容，在波长291 nm处测其吸光度值，见图3。

图3 不同料液比对提取效果的影响Fig.3 The effect of different solid-liquid ratios on extraction effect

由图3可知，当料液比增大时，提取效率随之增大，料液比1∶80时为最大值；此后继续增大料液比(1∶85)溶液的吸光度值有所下降，因此，从节约材料的角度考虑，以1∶80为最佳料液比条件。

2.2.3 不同超声时间对色素提取的影响

分别称取3份1.0 g的山楂粉，按照料液比1∶80加入浓度为65%的乙醇溶液，经超声处理(20，30，40 min)后，在50 ℃油浴条件下恒温提取50 min，过滤后定容，在波长291 nm处平行测量吸光度值，结果见图4。

由图4可知，提取效率随超声时间增长而提高，当超声时间为30 min时，溶液的吸光度值最大，继续延长超声时间至40 min，吸光度值反而下降。这是因为适当的超声波作用时间，可利用其空化作用和机械作用增大色素与提取剂接触面积，提高色素溶解程度；过长的超声作用，可能会对色素造成破坏，降低有效成分含量，不利于色素提取。故提取条件中最佳超声波作用时间为30 min。

图4 不同超声波时间对提取效果的影响Fig.4 The effect of different ultrasonic time on extraction effect

2.2.4 不同提取时间对色素提取的影响

称取7份1.0 g的山楂粉，按照乙醇浓度65%、料液比1∶80、超声时间30 min、提取温度50 ℃的提取条件分别提取不同时间，过滤后定容，在波长291 nm处测量吸光度值，结果见图5。

图5 不同提取时间对提取效果的影响Fig.5 The effect of different extraction time on extraction effect

由图5可知，提取时间在30～70 min内吸光度值逐渐增大，在70 min时吸光度值达到最大；当提取时间分别延长至80 min和90 min时，吸光度值略有下降且趋于稳定，说明在此提取条件下色素已全部溶于提取剂。故山楂红色素提取时间以70 min为佳。

2.2.5 不同提取温度对色素提取的影响

分别准确称取4份1.0 g的山楂粉，按照前面已经确定的乙醇浓度(65%)、料液比(1∶80)、超声时间(30 min)、提取时间(70 min)，在不同的油浴温度(30，40，50，60 ℃)下提取，过滤后定容，在波长291 nm处分别测量吸光度值，结果见图6中(a)。

由图6中(a)可知，提取效率随提取温度的上升而上升，在30～50 ℃范围内，提取温度越高，提取效果越好，50 ℃时吸光度值最大，60 ℃时吸光度值有所下降。因此，以50 ℃为中心对其两侧的温度(45，55 ℃)进行筛选，实验结果见图6中(b)，与50 ℃时吸光度值相比，45 ℃条件下的吸光度值更大，因此45 ℃为最佳提取温度。

(a)

(b)

2.3 正交实验确定最优提取条件

通过对各个单因素实验结果的分析，固定提取温度为45 ℃不变，选取乙醇浓度(60%、65%、70%)、料液比(1∶75、1∶80、1∶85)、超声时间(20，30，40 min)、提取时间(60，70，80 min)进行四因素三水平正交实验，筛选最优提取方案，具体实验方案见表1，实验结果见表2。

表1 L9(34)正交实验因素水平设计表Table 1 The factors and levels design table of L9 (34) orthogonal experiment

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal test results

由表2中极差R值可知，山楂红色素提取条件中4个因素对提取效果存在不同程度的影响，各影响因素对提取效果的影响力为：A(乙醇浓度)>B(料液比)>D(提取时间)>C(超声时间)，其中最重要的影响因素是乙醇浓度。由正交实验结果可知，提取山楂红色素的最优方案是A3B3C3D2，即乙醇浓度70%、料液比1∶85、超声时间40 min、提取时间70 min。

2.4 最优工艺条件验证实验

由于最佳提取方案并未出现在正交实验表中，为确保其真实性，在该提取工艺条件下进行了3 组重复验证实验，并取其平均值。由表3可知，验证实验结果具有代表性，表明该提取工艺条件是合理可行的，重现性好。

表3 重复实验结果Table 4 Repeated results of orthogonal experiment

3 结论与建议

通过对山楂粉中山楂红色素提取的单因素条件进行筛选，结果表明在单因素实验中每个单因素最佳条件分别为：乙醇浓度65%、料液比1∶80、超声时间30 min、提取时间70 min、提取温度45 ℃。通过对单因素实验分析，因温度变化对提取效果影响微弱，固定提取温度不变，其余4个单因素经正交实验设计，最佳提取工艺方案是：提取温度45 ℃、乙醇浓度70%、料液比1∶85、提取时间70 min、超声时间40 min。通过3次平行重复验证实验，所得吸光度值重现性较好，说明此工艺条件对山楂红色素的提取具有明显优势。

通过本文的研究，为高效提取山楂红色素提供了思路，而丰富的山楂红色素产品可以更好地满足我国食品加工行业对其的需求，获得更多兼具色、香、味和保健功效的食品和饮品，提升经济和社会效益。