Eg95包虫病基因工程亚单位疫苗免疫效果试验

杨继元 赵志刚 李国平 顾冬花 张才旦卓玛 杜梅卓 蔡金山 李静 张俊 赵全邦 胡广卫 沈艳丽

Eg95包虫病基因工程亚单位疫苗免疫效果试验

杨继元①赵志刚①李国平①顾冬花①张才旦卓玛①杜梅卓①蔡金山②李静②张俊①赵全邦②胡广卫②沈艳丽②

（①青海省大通县畜牧兽医站 810100 ②青海省动物疫病预防控制中心 青海 西宁）

为了解Eg95包虫病基因工程亚单位疫苗免疫牦牛的效果，以便为今后疫苗生产与推广使用提供科学的试验数据，大通县畜牧兽医站于2018年至2019年进行了包虫病基因工程疫苗免疫及免疫效果试验。结果表明：通过组间减囊率、个体荷虫量统计，试验用的Eg95蛋白基因工程疫苗在预防牛感染包虫或减少感染包虫数量方面有较好的效果，二免效果尤为明显。

包虫病 免疫效果 牦牛

包虫病是由寄生在犬等食肉动物小肠内的棘球绦虫的幼虫寄生于人或动物体内引起的人兽共患寄生虫病，几乎遍布全球。我县牛羊感染率约在15%以上，犬粪抗原阳性率在10%~21%。我国的内蒙古、四川、西藏、甘肃、青海、宁夏、新疆等7个省(自治区)的牧区和半农半牧区是棘球蚴病的严重受害区。其危害程度已到了危及人类生命、妨碍畜牧业生产发展、严重影响当地社会经济发展和因病致贫、因病返贫的地步。因此，为了解Eg95包虫病基因工程亚单位疫苗免疫牦牛的效果，以便为今后推广应用提供科学的试验数据，大通县畜牧兽医站于2018-2019年进行了包虫病基因工程疫苗免疫及免疫效果试验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 试验牛为大通县种畜繁殖场4月龄左右毛犊牛100头。

1.1.2 棘球绦虫 将购买的6条犬栓于笼内，用已感染包虫的内脏饲喂，经反复用ELISA法检测，粪抗原呈阳性时宰杀，逐条检查小肠内的棘球绦虫感染情况，并刮取已感染棘球绦虫犬的小肠黏膜置于干净的饮料瓶内，备用。

1.1.3 试验疫苗 注射所用的“包虫病基因工程亚单位疫苗”由重庆澳龙生物制品有限公司试制，疫苗批号2016001，规格为10头份/瓶，每头份含保护性抗原(Eg95蛋白)250µg和Quli A佐剂5mg。

1.1.4 检测试剂 检测试剂盒购自重庆澳龙生物制品公司，批号20170402。

1.2 试验方法

1.2.1 疫苗安全性观察方法 试验牛颈部皮下注射牛包虫病疫苗1头份/头(共含500µg的Eg95蛋白)，对照组试验牛注射相同体积的疫苗稀释液。注射后观察试验牛有无呕吐、抽搐、休克等应激反应和过敏反应，同时检测试验牛体温变化情况。

1.2.2 免疫与检测方法 （1）将100头试验牛经基础抗体检测后，剔除基础抗体OD450nm>0.3的牛，将包虫抗体阴性(OD450nm≤0.3)的牛不分性别随机分为免疫组、强化免疫组和对照组，每组20头，然后佩戴耳标并编号登记，按组进行免疫。（2）免疫组：对4月龄左右的犊牛20头采集血清后进行免疫，颈部皮下注射1头份的包虫病疫苗，分别于30、60d攻毒，攻毒后颈部采集静脉血，分离血清进行抗体检测。（3）强化免疫组(二免组)：对4月龄左右的犊牛20头采集血清后进行免疫，颈部皮下注射1头份的包虫病疫苗，30d时采集血清并进行第二次免疫，二次免疫30d攻毒、攻毒后颈部采集静脉血，分离血清。（4）对照组：采集血清按照相同方法颈部皮下注射无Eg95的疫苗稀释液，分别于0、30、60d攻毒、攻毒颈部采集静脉血，分离血清。

1.2.3 感染方法 将保存于饮料瓶内的新鲜的小肠粘膜，50倍稀释后灌服给免疫组、强化免疫组和对照组的试验牛各50ml。灌服完棘球绦虫后，所有试验牛均由同一牧工饲养于同一草场，期间用血清学方法检测抗体滴度。

1.2.4 剖检方法 随机抽取免疫组2头、强化免疫组2头和对照组3头试验牛采集血清，宰杀、分组统计其内脏组织中的包囊数量。

1.3 试验数据计算和处理

（1）试验中，由于试验牛是放牧牛，采样时放牧员不一定每次能将试验牛收集齐，且放牧牛野性大，不一定所有试验牛均能采上样品，所以在统计分析时剔除了采样次数低于3次的个体数据。（2）减囊率=(对照组囊包数-试验组囊包数)÷对照组囊包数×100%。（3）符合率=剖检阳性牛与血清学阳性符合数÷剖检牛总数×100%。（4）试验操作方法按试剂使用说明书进行。

1.4 结果判定标准

1.4.1 血清学结果判定方法和标准 试验结果同时满足下列条件，方为有效。标准阳性对照孔平均OD450nm≥0.6±0.02；标准阴性对照孔平均OD450nm≤0.3±0.02。

1.4.2 疫苗免疫后抗体水平检测结果的判定 样品OD450nm≤0.3，判为细粒棘球蚴(包虫)抗体阴性；样品OD450nm>0.3，判为细粒棘球蚴(包虫)抗体阳性；样品OD450nm处于0.3±0.02临界值范围内，建议重复检测，以确保结果准确。

1.4.3 对细粒棘球(包虫)免疫保护力检测结果的判定 样品OD450nm≤0.3，判为无保护力，所检样品对细粒棘球蚴感染无保护力；样品OD 450nm介于0.3与0.6之间，判为保护力低下，抗体水平较低，对细粒棘球蚴感染有一定保护力；样品OD450nm≥0.6，判为有保护力，所检样品抗体水平较高，在攻毒试验中可提供高于90%的抵抗力；样品OD450nm处于0.3±0.02或者0.6±0.02两个临界值范围内，重复检测，以确保结果准确。

2 结果与分析

2.1 血清学检测和剖检数量

表1 血清学检测和剖检数量 (份)

2.2 免疫试验结果

2.2.1 试验牛注射Eg95蛋白基因工程疫苗后，均未出现呕吐、抽搐、休克等应激反应或过敏反应，体温也无明显变化。说明该疫苗在牦牛上使用是安全的。

2.2.2 免疫抗体检测结果

表2 不同时间群体免疫抗体滴度 (头、%)

表3 不同时间免疫抗体阳性率统计结果 (头、%)

表4 不同时间免疫抗体有一定保护力有保护力个体数统计结果 (头、%)

从表2、3、4检测结果来看，各组供试牛基础抗体检测值均≤0.3，说明选择的供试牛细粒棘球蚴(包虫)抗体阴性，也就是说试验前供试牛未感染包虫。注射Eg95蛋白基因工程疫苗后30d时，群体平均免疫抗体滴度>0.3，个体阳性率为89.47%，群体抗体滴度>0.6，在攻毒试验中可提供高于90%抵抗力的牛达100%；从个体抗体滴度来看，免疫牛在攻毒试验中可提供高于90%抵抗力的牛只有68.42%，10.52%的牛免疫抗体呈阴性，其因有可能是个体对疫苗的敏感性或者是检测试剂的敏感性或者因加样等操作造成的。60d时，一免组群体平均免疫抗体滴度>0.3、个体阳性率为60%，个体免疫抗体滴度≥0.6，在攻毒试验中可提供高于90%的抵抗力的牛占40%，介于0.3与0.6之间、抗体水平较低，对细粒棘球蚴感染有一定保护力的牛占20%，对细粒棘球蚴感染无保护力的占40%，而二免组免疫抗体水平继续在上升，群体和个体抗体>0.3、群体和个体阳性率达100%，个体免疫抗体滴度≥0.6，在攻毒试验中可提供高于90%的抵抗力的牛为100%。384d时，一免组群体平均免疫抗体滴度>0.3，个体阳性率为57.14%，个体免疫抗体滴度≥0.6，在攻毒试验中可提供高于90%的抵抗力的牛只有14.28%，介于0.3与0.6之间、抗体水平较低，对细粒棘球蚴感染有一定保护力的牛占28.57%对细粒棘球蚴感染无保护力的占57.14%，二免组群体平均免疫抗体滴度>0.3，个体阳性率为60%，个体免疫抗体滴度≥0.6，在攻毒试验中可提供高于90%的抵抗力的牛有40%，介于0.3与0.6之间、抗体水平较低，对细粒棘球蚴感染有一定保护力的牛占20%，对细粒棘球蚴感染无保护力的占40%。

2.3 剖检试验结果

2.3.1 不同组不同部位荷虫数

表5 不同组不同部位荷囊数 (头)

从表5剖检数据来看，包虫在牦牛内脏器官中，肺脏的荷虫数最多，其次是肝，第三位是脾，第四位是肾，第五位是心脏，囊经最大28mm,最小0.9mm,对照组、一免组、二免组平均荷虫量分别为351.67、207.67、13.67个，其他部位未发现囊包；134个包囊396张片镜检均未检出原头蚴；一免组囊包数数与对照组相比，其减囊率为40.95%，二免组与一免组相比，减囊率为93.42%，二免组与对照组相比，减囊率为96.11%。结果表明，虽然Eg95蛋白基因工程疫苗在预防牛感染包虫或减少感染包虫数量方面有较好的效果，但每一组牛都感染了包虫，其因有可能与攻毒时机不准确或攻毒量过大有关。

2.3.2 剖检牛个体血清学和结果阳性符合性对比

表6 各组试验牛个体血清学和剖检结果

（1）表6对照组6头牛中3头攻毒后234d时抗体滴度均有所升高，至767d时除7715号牛抗体持续上升外，其余两头抗体滴度反而有所下降；一免组7721号牛免疫后30d、和攻毒后234d时抗体上升很快，抗体滴度也很高，但到免疫后60d、攻毒后767d时抗体滴度很快下降了下来，7505号免疫和攻毒后抗体滴度上升快，免疫和攻毒后抗体滴度下降比较缓慢；二免组7514号牛一免、二免后抗体上升快，抗体滴度维持比较稳定、且产生的抗体滴度比较高，攻毒后抗体滴度有所上升，但幅度不大，7521号牛一免后上升的抗体滴度比较低，二免后抗体有明显的上升，但到攻毒时抗体已下降了一免后的水平，攻毒后抗体不但没有上升，反而有所下降。该结果表明：在不考虑疫苗的前提下，免疫抗体产生与否，产生抗体的滴度高与低主要与牛的个体因素有关；该试剂可用于免疫牛产生抗体产生的水平和免疫抗体消长，但不能区分抗体是自然感染还是免疫而产生的抗体。（2）若依据疫苗免疫后抗体水平判定，剖检和血清学检测的阴性符合率为0，阳性符合率为57.14%(4/7)；若依免疫保护力判定，阴性符合率为0，阳性符合率为28.56(2/7)。结果进一步证明，该试剂不能真实反映感染抗体检测的结果，因而不能用于个体感染包虫与否的诊断。

2.3.3 血清学抗体

表7 试验牛组间血清学和剖检结果 (头)

表7可以看得出各组免疫和攻毒后产生的抗体呈曲线型上升或下降，同时组间统计数据同样表明了3.3.2的分析结果。

3 结论

（1）组间减囊率、个体荷虫量统计数据表明，试验用的Eg95蛋白基因工程疫苗在预防牛感染包虫或减少感染包虫数量方面有较好的效果，二免效果尤为明显。但本试验中，有可能是因为攻毒时机把握不准或攻毒量过大或其他因素影响，每一组牛都有包虫感染，具体何因尚待进一步探讨[4]。（2）剖检牛免疫、攻毒后抗体滴度变化证明，在不考虑疫苗因素的前提下，免疫抗体产生与否[6]，产生抗体的滴度高与低主要与牛的个体因素有关。（3）剖检牛个体、群体血清学检测数据和剖检符合率说明，实验用免疫抗体试剂盒的免疫抗体检测试剂可用于免疫牛产生抗体水平和抗体消长的检测[7]，但该试剂不能区分自然感染抗体和免疫抗体，因而不能用于个体感染包虫与否的诊断。

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（2020–04–21）

青海省人畜包虫病防控策略与创新技术应用，2016-SF-A5；青海省第二批、第三批“高端创新人才千人计划”

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