miR-499、miR-16、肌红蛋白与常规心肌损伤标志物的关系及在急性心肌梗死早期诊断中的价值

李刚 朱春凯 郑培明

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发病急骤，是一种严重威胁人类健康的心血管疾病，随着血运重建技术的发展与进步，病死率有所降低，但仍是冠心病死亡的最主要原因之一，而是否能早期明确诊断，指导临床及时进行治疗是改善患者预后的关键［1-2］。肌钙蛋白I（Cardiac troponini I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）是诊断AMI 常用的心肌损伤标志物，特异性较高，但多在AMI 发病3 h 后明显升高，不利于疾病的早期诊断［3-4］。微小RNA 是一类高度保守的非编码小分子RNA，由19～25 个核苷酸组成，虽然不编码蛋白质，但能调控靶基因降解、稳定性、蛋白质翻译等，参与细胞的增殖、分化、凋亡［5］。有研究显示，微小RNA 在血浆中稳定存在，AMI 可引起患者循环中部分微小RNA的表达异常，具有疾病生物学标记的潜在特性［6-7］。微小RNA-499（microRNA-499，miR-499）、微小RNA-16（microRNA-16，miR-16）是两种微小RNA，是否与cTnI、CK-MB 有关及能否用于AMI的早期诊断尚不明确。肌红蛋白（myoglobin，MYO）在AMI 患者中呈高表达，但在发病后表达的时间效应仍不清楚［8］。鉴于此本研究探讨miR-499、miR-16、MYO 与常规心肌损伤标志物的关系及在AMI 早期诊断中的价值，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2017年2月至2019年12月本院收治的134 例AMI 患者（AMI 组）及体检中心134 例健康人群（对照组）。其中AMI 组女65 例，男69 例平均（63.95±6.94）岁，体质量指数19～26 kg/m2，平均（22.29±1.60）kg/m2；对照组女70 例，男64 例，平均（64.05±6.89）岁，体质量指数19～26 kg/m2，平均（22.33±1.57）kg/m2。两组性别、年龄、体质量指数等资料均衡可比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：①AMI 组均符合AMI 诊断标准［9］；②发病至入院时间＜2 h；③无风湿性心脏病；④无病毒性感染等感染类疾病。排除标准：①有心脏瓣膜病、心房纤颤者；②先天性心脏病者；③合并恶性肿瘤者；④伴有肝肾肺功能严重不全者；⑤急性脑血管疾病者；⑥肺栓塞者；⑦心肌炎者，主动脉夹层者。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂、仪器

cTnI、CK-MB 检测试剂盒（深圳市科润达生物工程有限公司）；总RNA 提取试剂盒（上海索宝生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（广州泛思生物科技有限公司）；引物合成（北京擎科）；赛博绿色荧光染料实时PCR 反应混合液（北京智杰方远科技有限公司）；实时定量PCR 仪（美国Biosystems公司，ABI7300）。

1.3.2 血cTnI、CK-MB、miR-499 mRNA、miR-16 mRNA 检测

采集AMI 组发病后2、6、12 h 及对照组入院后次日清晨空腹肘部静脉血，采用酶联免疫吸附法检测血清cTnI、CK-MB 水平，采用实时荧光定量PCR法检测血miR-499 mRNA、miR-16 mRNA 表达。

1.3 观察指标

①比较两组常规心肌损伤标志物：cTnI、CKMB 表达。②比较两组miR-499 mRNA、miR-169 mRNA、MYO 的表达。③分析miR-499、miR-16、MYO 之间的相关性。④分析miR-499、miR-16、MYO 与cTnI、CK-MB 相关性。⑤分析miR-499、miR-16、MYO 在AMI 早期诊断中的价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行处理数据，计量资料以（）表示，多组间比较以单因素方差分析，两两比较以LSD-t检验，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验，采用Pearson 分析各指标间相关性，采用接收者操作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线及ROC 下面积（Area under the curve，AUC）分析各指标在AMI 早期诊断中的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组常规心肌损伤标志物的表达

发病2 h 时，AMI 组cTnI、CK-MB 与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；发病6、12 h，AMI 组cTnI、CK-MB 均高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组常规心肌损伤标志物的表达比较（±s）Table 1 Comparison of expression of conventional myocardial injury markers between the 2 groups（±s）

表1 两组常规心肌损伤标志物的表达比较（±s）Table 1 Comparison of expression of conventional myocardial injury markers between the 2 groups（±s）

组别AMI 组2 h 6 h 12 h对照组F 值P 值n 134 134 cTnI（μg/L）0.25±0.05 9.12±2.23 20.42±5.65 0.23±0.04 1331.381＜0.001 CK-MB（U/L）18.11±4.68 24.59±6.13 73.58±14.25 17.84±3.79 1398.770＜0.001

2.2 两组miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO的表达

发病2、6、12 h 时，AMI 组miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 AMI 组miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 的表达比较（±s）Table 2 Comparison of miR-499 mRNA，miR-16 mRNA，and MYO expression in the AMI group（±s）

表2 AMI 组miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 的表达比较（±s）Table 2 Comparison of miR-499 mRNA，miR-16 mRNA，and MYO expression in the AMI group（±s）

组别AMI 组2 h 6 h 12 h对照组F 值P 值n miR-499 mRNA miR-16 mRNA MYO（μg/L）134 134 1.48±0.50 2.69±0.72 2.75±0.68 1.09±0.39 276.104＜0.001 2.09±0.77 2.78±0.85 2.25±0.69 1.18±0.46 118.531＜0.001 68.98±19.12 132.38±28.44 342.08±33.27 53.02±12.44 3899.732＜0.001

2.3 分析miR-499、miR-16、MYO 之间的相关性

miR-499 mRNA 与miR-16 mRNA（r=0.642）呈正相关，与MYO（r=0.473）呈正相关；miR-16 mRNA与MYO（r=0.473）呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.4 分析miR-499、miR-16、MYO 与cTnI、CK-MB相关性

cTnI、CK-MB 与miR-499（r1=0.496，r2=0.519）、miR-16（r1=0.496，r2=0.557）、MYO（r1=0.501，r2=0.547）呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.5 分析miR-499、miR-16、MYO 在AMI 早期诊断中的价值

ROC 分析显示，miR-16 诊断早期AMI 的AUC最大，其次是miR-499、MYO，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图3。

3 讨论

目前AMI 的诊断主要依赖临床症状、心电图、心肌损伤标志物的变化，对具有以上病理特征变化的典型AMI，早期明确诊断较为容易，但长期临床工作发现，早期缺乏AMI 典型症状的患者并不少见，且有较大比例患者心电图无典型改变，以致不能获得及时再灌注治疗，严重影响患者的预后，这使得心肌损伤标志物的检测起相当重要的作用［10］。CK-MB、cTnI 是常用的心肌损伤标志物，本研究结果提示AMI 发病早期cTnI、CK-MB 无显著变化，这一发现与既往的观点［11］一致。cTnI 是心肌的特有分泌物，在AMI 后，3～6 h 开始释放，10～24 h 达到高峰［12］；CK-MB 在心肌损伤后，3～8 h 后开始升高，可持续3～5 d，提示CK-MB、cTnI 在AMI 早期诊断中有一定的局限性［13］。因此有必要研究其他有效的心肌标志物。

表3 ROC 分析结果Table 3 ROC analysis results

miR-499、miR-16 均是微小RNA 家族成员。终末期肾病合并AMI 患者外周血miR-499 mRNA高于未合并AMI 患者，提示miR-499 mRNA 与AMI 发生有关［14］。miR-16 在体外培养新生大鼠心室细胞中的过度表达降低了细胞活力，增加了细胞凋亡，相反miR-16 特异性抑制剂能逆转以上变化，用miR-16 慢病毒过度表达miR-16，可显著增加AMI 大鼠心肌梗死面积，加重心功能不全，而慢病毒介导miR-16 基因敲除可减轻急性心肌损伤，可见miR-16 参与AMI 发病与病情恶化［15］。但两者是否有助于AMI 的早期诊断尚不清楚。结合文献分析，AMI 发生后在缺氧/复氧刺激下，心肌细胞可释放miR-499，导致miR-499 表达升高，并介导内皮损伤标志物表达明显增加，引起内皮损伤，从而参与AMI 发病及病情进展［16］。由于研究的前沿性，缺乏相关循证资料，仍不清楚miR-16 通过何种途径参与AMI，但本研究采用Pearson 分析发现，miR-499 mRNA 与miR-16 mRNA 呈正相关，表明两者可相互影响发挥作用，且发病12 h miR-499、miR-16 均与CK-MB、cTnI 呈正相关，有作为心肌损伤标志物的潜质。后续的ROC 分析显示，miR-499 诊断早期AMI，miR-16 均呈现出一定的诊断价值，可为临床诊断早期AMI 提供量化数据参考。

MYO 是肌细胞等储存和分配氧的蛋白质，心肌中含量特别丰富，在心肌缺血大鼠中表达明显升高［17］。本研究提示MYO 可能有助于AMI 的早期诊断。石萍等［18］指出，MYO 在AMI 发病早期，0～3 h 后血中即可升高，佐证了MYO 可作为AMI早期诊断的敏感指标。本研究不足之处在于，未分析各指标联合的诊断价值，有待后续的进一步探讨。

综上所述，miR-499、miR-16、MYO 在AMI发病早期即升高，各指标间呈正相关，并与cTnI、CK-MB 呈正相关，可作为AMI 早期诊断的标志物。