一测多评法同时测定瑶药月里瑶秘喷雾剂中7种有效成分的含量

2020-07-23张競之赵丹青王正蓉贾金艳杨林张升盛刘歆蕾伍庆潘卫

中国药房 2020年9期

张競之赵丹青王正蓉贾金艳杨林张升盛刘歆蕾伍庆潘卫

中圖分类号 R917;R29 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）09-1044-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.05

摘要目的：建立一测多评（QAMS）法同时测定瑶药月里瑶秘喷雾剂中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯等7种有效成分的含量，为该制剂质量控制提供方法参考。方法：采用气相色谱法进行测定。色谱柱为DB-1701P毛细管柱，载气为氮气，氢火焰离子检测器的温度为240 ℃，程序升温，进样口温度为240 ℃，进样量为1 μL，分流比为20 ∶ 1。以柠檬烯为内参物，计算其余6种成分的相对校正因子，再根据相对校正因子计算出6种成分的含量，并与内标法（以萘为内标物）测定结果进行比较。结果：α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯检测质量浓度的线性范围分别为0.008 9～1.110 0、0.028 3～3.540 0、0.020 5～2.560 0、0.023 0～2.880 0、0.016 3～2.035 0、0.013 1～1.640 0、0.008 3～1.040 0 mg/mL（r均大于0.999 0）;定量限分别为0.005 6、0.013 1、0.011 4、0.018 6、0.010 8、0.008 9、0.004 5 mg/mL;检测限分别为0.001 9、0.004 1、0.003 7、0.006 2、0.003 5、0.002 9、0.001 5 mg/mL;精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均小于2%（n=5或n=6）;平均回收率分别为98.48%、101.37%、97.96%、99.80%、102.79%、97.77%、102.14%，RSD均小于2%（n=9）。α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的平均相对校正因子分别为1.045 8、0.621 0、0.488 5、0.382 9、0.708 9、0.956 9，RSD均小于2%（n=6）。QAMS法和内标法测得的7种成分的含量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：建立的QAMS法简便、准确、稳定且重现性良好，可用于月里瑶秘喷雾剂中7种成分的同时测定。

关键词一测多评法;瑶药;月里瑶秘喷雾剂;气相色谱法;质量控制

Simultaneous Determination of 7 Effective Components in Yao Medicine Yueli Yaomi Spray by QAMS

ZHANG Jingzhi1，ZHAO Danqing2，WANG Zhengrong1，2，JIA Jinyan3，YANG Lin3，ZHANG Shengsheng4，LIU Xinlei1，WU Qing4，PAN Wei1，2（1.School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;2.Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;3.Guizhou Hongyu Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550001， China;4.Guizhou Key Laboratory of Mountainous Environment Information System and Environment Protection/Analysis and Measurement Center， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish QAMS method for simultaneous determination of 7 effective components in Yao medicine Yueli yaomi spray， such as α-cyperone， α-pinene， β-pinene， limonene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide， so as to provide method reference for the quality control of the preparation. METHODS： GC method was adopted. The determination was performed on DB-1701P capillary column， using nitrogen as carrier gas. The temperature of the hydrogen flame ion detector was 240 ℃. The temperature was programmed， the inlet temperature was 240 ℃， the injection volume was 1 μL and the split ratio was 20 ∶ 1. Using limonene as internal reference， the relative correction factors of other 6 components were calculated， the contents of them were calculated with relative correction factors， and then compared with the results of internal standard method （using naphthalene as internal standard）. RESULTS： The mass concentration linear range of α-cyperone， α-pinene， β-pinene， limonene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide were 0.008 9-1.110 0， 0.028 3-3.540 0， 0.020 5- 2.560 0， 0.023 0-2.880 0， 0.016 3-2.035 0， 0.013 1-1.640 0， 0.008 3-1.040 0 mg/mL （all r>0.999 0）; the limits of quantification were 0.005 6， 0.013 1， 0.011 4， 0.018 6， 0.010 8， 0.008 9， 0.004 5 mg/mL; the detection limits were 0.001 9， 0.004 1， 0.003 7， 0.006 2， 0.003 5， 0.002 9， 0.001 5 mg/mL; RSDs for precision， stability （24 h）， and repeatability tests were all less than 2% （n=5 or n=6）; the average recoveries were 98.48%， 101.37%， 97.96%， 99.80%， 102.79%， 97.77%， 102.14%， and RSDs were all lower than 2% （n=9）， respectively. The average relative correction factors of α-cyperone， α-pinene， β-pinene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide were 1.045 8， 0.621 0， 0.488 5， 0.382 9， 0.708 9， 0.956 9 respectively， and the RSDs were all lower than 2% （n=6）. There was no statistical significance in contents of 7 components between QAMS method and internal standard method （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established QAMS method is simple， accurate， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination for 7 components in Yueli yaomi spray.

KEYWORDS QAMS; Yao medicine; Yueli yaomi spray; GC; Quality control

妊娠期糖尿病是一种妊娠期常见的并发症，其极易增加妊娠相关母儿并发症的风险，并且患有该病的孕妇常伴随较严重的忧郁多虑、焦躁易怒等不良情绪[1-2]。同时，产后妇女多有元气大损、气血亏虚、瘀血的表现，临床需要安全、温和、毒副作用少的药物来辅助孕产妇的机体恢复。依据瑶医学核心“盈亏平衡理论”，产后妇女的身体虚弱、气血不畅均为亏虚引起。瑶医用药原则是“亏则补之”，治疗亏症以和缓、平调脏腑的“风药”为主[3-4]。月里瑶秘喷雾剂是由香附和当归两味药经山茶油调配而成的瑶药，其中以香附为主要药材，当归辅之，且两者皆属“风类药”。该制剂具有较好的镇静安抚、补血理气、解痉镇痛、抗炎抑菌功效，对患有妊娠糖尿病并伴有焦虑不安情绪的孕产妇具有较好的镇定舒缓作用，可辅助产后机体恢复。方中香附气平，味辛，理气解郁;当归性温，味甘，补血活血;两者皆有调经止痛之功效[5]。香附的主要成分多集中在挥发油中，主要有α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、氧化石竹烯等，其中α-香附酮可调经解痛[6]，氧化石竹烯能促进细胞修复和再生，α-蒎烯、β-蒎烯和β-榄香烯有抑菌作用，并且香附中总黄酮、β-香附酮等还具有降血糖、调血脂之功效[7]。当归的主要有效成分藁本内酯、α-蒎烯等，也存在于挥发油中[8-9]，其中藁本内酯有很强的镇定解痉功效，对平滑肌有明显的松弛作用[10]。

月里瑶秘喷雾剂作为以孕产妇为适用人群的瑶药，对其进行有效质量控制必不可少。香附与当归含有多种有效化学成分，但在缺乏某些对照品或需严格控制成本时，逐一对多种成分进行质量控制费时费力。有文献报道，可采用气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）等方法测定香附、当归中有效成分含量[11-14]，却未有研究能全面有效地对月里瑶秘喷雾剂中香附与当归进行质量控制。2010年版《中国药典》（一部）首次收录了一测多评（QAMS）法，该法通过测定样品中某一成分含量，建立其余各成分的相对校正因子，从而计算出各成分的含量，具有显著降低药物质量控制成本、高效同步测定多个成分的特点[15-16]。因此，本研究采用QAMS法，以柠檬烯为内参物，建立同时测定月里瑶秘喷雾剂中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯等7种有效成分含量的GC法，以期为月里瑶秘喷雾剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7890B型GC仪、7683型自动进样装置、氢火焰离子化检测器、DB-1701P型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）均购自美国Agilent公司;XS-105型电子天平（瑞士Mettler -Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

月里瑶秘喷雾剂（批号：20190313、20190521、20190807、20191029，规格：20 mL/瓶）和缺香附的阴性样品、缺当归的阴性样品、缺山茶油的阴性样品以及缺香附、当归、山茶油的阴性样品（批号均为20190917，规格：20 mL/瓶）均由贵州宏宇药业有限公司提供;α-蒎烯对照品（批号：D8-11-4，纯度：≥98%）、β-蒎烯对照品（批号：127-97-3，纯度：≥98%）均购于上海麦克林生化有限公司;柠檬烯对照品（北京北纳创联生物技术研究院，批号：180109，纯度：≥98%）;β-榄香烯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100268-200401）;氧化石竹烯对照品（批号：A20N10L103699）、α-香附酮对照品（批号：Z08A10L94945）、藁本内酯对照品（批号：R06S10F97- 106）均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均不低于98%;内标萘（天津市鼎盛鑫化工有限公司，批号：20161103，纯度：≥99.7%）;二氯甲烷等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 内标溶液精密称取适量内标萘，用二氯甲烷溶解并制备成质量浓度为1.68 mg/mL的内标溶液。

2.1.2 混合对照品溶液分别精密称取α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯等7种对照品适量，用二氯甲烷溶解并制成上述各成分质量浓度分别为2.22、7.08、5.12、5.76、4.07、3.28、2.08 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各贮备液83、32、425、795、205、114、215 μL以及内标溶液500 μL，置于同一5 mL量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀，即得上述7种成分质量浓度分别为0.037、0.045、0.435、0.916、0.167、0.075、0.089 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液分别精密量取月里瑶秘喷雾剂和内标溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度，混匀，即得。

2.1.4 阴性样品溶液取缺香附的阴性样品、缺当归的阴性样品、缺山茶油的阴性样品以及缺香附、当归、山茶油的阴性样品，分别按“2.1.3”项下方法制备成相应的阴性样品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：DB-1701P毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;载气：氮气（纯度：>99.999%）;氢火焰离子检测器温度：240 ℃;程序升温（初始温度50 ℃，保持1 min;以1 ℃/min升到65 ℃，保持2 min;再以5 ℃/min升到105 ℃，并立即以10 ℃/min升到120 ℃，再立即以 4 ℃/min升到152 ℃，保持1 min;再以8 ℃/min升到190 ℃，最后以5 ℃/min升到250 ℃）;进样口温度：240 ℃;进样量：1 μL;分流比：20 ∶ 1。分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各1 μL，分别注入GC仪进行测定，记录色谱图。结果顯示，各成分峰均能达到基线分离，分离度均大于3，理论板数以各待测成分计均大于3 000，且阴性样品无干扰。色谱图详见图1。

2.3 线性关系考察

取“2.1.2”项下α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯单一对照品贮备液（各成分贮备液均按0.02、0.50、1.00、1.50、2.50 mL精密吸取），分别置于5 mL量瓶中，精密加入“2.1.1”项下内标溶液1 mL，用二氯甲烷定容至刻度，混匀，制成单一对照品的系列线性溶液。取上述线性溶液按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以各成分与内标质量浓度的比值为横坐标（x）、峰面积的比值为纵坐标（y）进行回归分析。结果显示，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯在各自相应的质量浓度范围内线性关系均良好（r>0.999 0），结果详见表1。

2.4 定量限与检测限考察

取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，以二氯甲烷进行倍比稀释后，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，当信噪比为10 ∶ 1、3 ∶ 1时分别测得定量限和检测限。结果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的定量限分别为0.005 6、0.013 1、0.011 4、0.018 6、0.010 8、0.008 9、0.004 5 mg/mL，检测限分别为0.001 9、0.004 1、0.003 7、0.006 2、0.003 5、0.002 9、0.001 5 mg/mL。

2.5 精密度试验

取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.2”色谱条件下连续进样6次，记录峰面积。结果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯峰面积与内标峰面积比值的RSD分别为0.24%、0.17%、0.31%、0.12%、0.27%、0.08%、0.14%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.1.3”项下供试品溶液（批号：20190313），分别于室温下放置0、3、6、12、24 h时按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的峰面积与内标峰面积比值的RSD分别为0.75%、0.85%、0.71%、0.79%、0.64%、0.59%、0.68%（n=5），表明该供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.7 重复性试验

取月里瑶秘喷雾剂样品（批号：20190313），按“2.1.3”项方法平行制备6份供试品溶液，然后按“2.2”项色谱条件进样测定，记录峰面积，并按内标法计算各成分含量。结果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的平均含量分别为0.023 2、0.055 0、0.169 5、0.841 4、0.133 8、0.113 8、0.077 8 mg/mL，RSD分别为0.94%、0.76%、0.87%、0.72%、0.79%、0.83%、0.69%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的同一批月里瑶秘喷雾剂样品（批号：20190313） 0.5 mL ，共9份，分别按已知成分含量的80%、100%、120%加入相应的单一成分对照品贮备液，然后按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的回收率。结果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的平均加样回收率分别为98.48%、101.37%、97.96%、99.80%、102.79%、97.77%、102.14%，RSD分别为0.80%、1.37%、1.32%、0.67%、0.80%、0.97%、0.86%（n=9），表明该方法准确度较好，详见表2。

2.9 相对校正因子的计算

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，共6份，分别按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以柠檬烯为内参物，计算各化合物的校正因子：f=[Ai/ci

As/cs] 。式中，Ai为内标物峰面积，ci为内标物质量浓度，As为其他组分s的峰面积，cs为其他组分s的质量浓度。然后再计算α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯相对于柠檬烯的相对校正因子：Rf=fs/f柠檬烯。式中，fs为其他组分s的校正因子。结果显示，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯的平均相对校正因子分别为1.045 8、0.621 0、0.488 5、0.382 9、0.708 9、0.956 9，RSD分别为1.10%、1.23%、1.15%、1.51%、1.02%、0.75%（n=6），表明各成分相对校正因子的准确性较好。

2.10 待测组分色谱峰的定位

采用相对保留时间法进行色谱峰的定位。精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，共4份，分别按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录各色谱峰的保留时间并计算α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯相对于柠檬烯的保留时间差：ΔtRs/R柠檬烯=tRs-tR柠檬烯。式中，tRs为其他成分s的保留时间，tR柠檬烯为内标物柠檬烯的保留时间。结果显示，以上6个成分相对于柠檬烯的保留时间差分别为29.377、5.510、3.224、18.407、25.170、30.105 min，RSD分别为0.13%、0.24%、0.17%、0.11%、0.28%、0.19%（n=4）。

2.11 样品含量测定

取3批月里瑶秘喷雾剂样品（批号：20190521、20190807、20191029），分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液后，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别采用内标法和QAMS法计算3个批次样品中7种成分的含量。应用SPSS 19.0 统计软件对2种方法测得结果进行t检验分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。结果显示，2 种方法测定的7种成分的含量差異均无统计学意义（P>0.05），表明QAMS法用于同时测定月里瑶秘喷雾剂多种成分是可行的。7种成分的含量测定结果见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

在前期研究中，笔者通过程序升温考察了初始温度、升温速率以及分流比对色谱峰分离度的影响，确定了最终色谱条件为初始温度50 ℃、分流比20 ∶ 1。此外，笔者分别考察了DB-1701P（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）等4种石英毛细管柱的分离效果。结果显示，型号为DB-1701、HP-5、DB-WAX的 3种色谱柱无法将目标峰与杂质峰分离，而型号为DB-1701P的色谱柱在分离度、峰形、响应值方面均较其他色谱柱效果更好，更适用于月里瑶秘喷雾剂的成分分析。

3.2 内标物的选择

由于月里瑶秘喷雾的成分复杂，相比于外标法，采用内标法检测的结果会更加准确。笔者前期分别将萘、邻苯二甲酸二甲酯、水杨酸甲酯、丙二酸二乙酯等作为内标候选物进行了考察。结果发现水杨酸甲酯、丙二酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯的出峰时间与样品中部分峰重合;而萘的出峰位置在柠檬烯与β-榄香烯之间，且分离效果良好，可防止系统误差的产生。因此，在本研究中选择萘作为内标物进行含量测定。

3.3 内参物的选择

笔者在研究中发现，β-榄香烯和柠檬烯在月里瑶秘喷雾剂中的含量均较高且较稳定。但从质控成本角度来看，柠檬烯较β-榄香烯价格更低廉、出峰时间更快，且附近的干扰峰也较少。根据QAMS法内参物易得、价廉、有效、稳定的选择原则[10]，本研究最终选擇柠檬烯作为内参物进行相对校正因子的计算。

综上所述，本研究以萘为内标物，首次建立了QAMS法同时测定月里瑶秘喷雾剂中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-榄香烯、氧化石竹烯、藁本内酯7种有效成分的含量，且和内标法测得的结果差异无统计学意义。本研究建立的QAMS法进行月里瑶秘喷雾剂的质量控制是可行的，可为该制剂的全面质量控制奠定基础。

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