氯喹对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

王 宁， 朱莹莹， 张姣姣， 周罗成， 康 健， 王海嵘

（上海交通大学医学院附属新华医院急诊医学科，上海 200092）

血管内皮细胞衬于血管内壁， 不仅可以调节物质交换，还具有分泌、免疫、调节周围器官反应等功能，其损伤见于感染、肿瘤等多种疾病中[1]。脓毒症是机体对感染的失调性宿主反应引起的危及生命的器官功能障碍， 而内皮细胞功能障碍是脓毒症导致器官损伤的重要原因之一[2]。关于脓毒症发生时内皮细胞功能障碍的机制尚不明确， 研究表明， 细胞的炎症损伤和凋亡在其中起到重要作用[2]。 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）广泛应用于诱导内皮细胞凋亡、 建立脓毒症内皮细胞损伤模型[3-4]，因此本研究应用LPS 诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）损伤。

氯喹（chloroquine，CQ）是一种抗疟疾药，不仅由于抗炎、免疫调节等特性用于治疗自身免疫性疾病[5]，还通过诱导肿瘤细胞凋亡应用于癌症治疗中[6-7]。目前有研究发现，CQ 可以通过抑制炎症因子降低脓毒症小鼠的死亡率[8]，但CQ 对脓毒症内皮细胞损伤的作用及机制尚不明确。 本实验旨在研究CQ对LPS 诱导的HUVEC 损伤的影响，并探讨可能的作用机制。

材料与方法

一、材料

细胞株HUVEC 购自中国科学院上海细胞生物学研究所。 LPS[大肠杆菌（Escherichia coli）055:B5]购自美国Sigma-Aldrich 公司，CQ 购自美国Cell Signaling Technology 公司， 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物技术有限公司；膜联蛋白Ⅴ（annexin Ⅴ）、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)凋亡检测试剂盒购自日本同仁化学研究所； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、BCL-2、BAX、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 标记山羊抗小鼠、HRP 标记山羊抗兔抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、 裂解的胱天蛋白酶3 （cleaved caspase 3） 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. 细胞分组与处理：取对数生长期的HUVEC，计数后用90%DMEM 高糖培养基和10%胎牛血清组成的完全培养基配置成浓度为1×105个/mL 的细胞悬液接种于细胞培养板中。根据不同处理将细胞分为对照组，LPS 组，低、中、高浓度CQ 组，对照组即不经药物处理的细胞，LPS 组即用浓度为10 μg/mL 的LPS 作用细胞， 低、 中、 高浓度CQ 组即在LPS 作用基础上分别加入浓度为0.1、1 和10 μmol/L 的CQ 作用细胞；各组细胞培养24 h 后进行细胞活力、凋亡检测。

2. CCK-8 检测细胞活力： 将HUVEC 接种在96 孔板中，每孔100 μL，待细胞过夜后按实验分组分别加入LPS、CQ 作用细胞24 h，然后加入CCK-8 10 μL/孔，在37℃培养箱共同孵育2 h 后，用酶标仪在450 nm 波长测定吸光度（A 值）， 细胞活力=[（实验组A 值-空白组A 值）/（对照组A 值-空白组A 值）]×100%。

3. 流式细胞仪检测细胞凋亡：将HUVEC 接种在6 孔板中，按上述处理24 h 后，收集细胞上清液及用无乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化下来的细胞至离心管中，1 000 转/min 离心3 min 后弃上清，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，1 000 转/min 离心3 min 后弃上清，然后加入1×膜联蛋白Ⅴ结合液，制成终浓度为1×106个/mL 的细胞悬液。取100 μL 细胞悬液至流式管中，加入5 μL 膜联蛋白Ⅴ, FITC 结合物和5 μL 碘化丙啶 （propidium iodide，PI）溶液，室温避光培养15 min 后加入400 μL 1×膜联蛋白Ⅴ结合液，上机检测。

4. 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白的表达：将HUVEC 接种在6 孔板中，按上述处理24 h后， 用放射免疫沉淀实验（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，然后用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳120 min，300 mA 横流转膜80 min 及快速封闭液封闭15 min 后，与BCL-2（1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、裂解的胱天蛋白酶3 （1∶1 000）、LC3 （1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体4℃孵育过夜。 次日用TBST洗涤5 min×4 次， 加入HRP 标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，再用TBST洗涤5 min×4 次后进行曝光显影。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0 及Graphpad Prism 6.0 软件进行统计分析及绘制。 计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD法。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、CQ 对HUVEC 细胞活力的影响

通过CCK-8 法分析细胞活性发现， 与对照组比较，10 μg/mL LPS 能明显降低细胞活力 （P＜0.05）；加入CQ 作用后，与LPS 组比较，低、中浓度CQ 组能一定程度上减轻LPS 诱导的细胞活力降低（P＜0.05）， 高浓度CQ 作用后细胞活力与LPS 组差异无统计学意义（P＞0.05），但低于低、中浓度CQ 作用组（P＜0.05）（见表1）。

二、CQ 对HUVEC 细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪检测细胞凋亡发现，与对照组相比， LPS 组细胞凋亡率高于对照组， 差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS 组相比，用低、中浓度CQ处理细胞后，细胞凋亡率降低（P＜0.05），高浓度CQ作用后细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05），但高浓度CQ 导致的细胞凋亡率较低、 中浓度CQ 组有所升高（P＜0.05）（见表1）。

表1 不同浓度CQ 对HUVEC 细胞活力、细胞凋亡的影响（均n=5，±s/%）

表1 不同浓度CQ 对HUVEC 细胞活力、细胞凋亡的影响（均n=5，±s/%）

1）：与对照组比较，P＜0.05；2）：与LPS 组比较，P＜0.05；3）：与低浓度CQ组比较，P＜0.05；4）：与中浓度CQ 组比较，P＜0.05

组别 细胞活力 细胞凋亡对照组 97.5±3.85 8.17±2.07 LPS 组 71.23±3.491） 25.47±2.281）低浓度CQ 组 82.57±4.102） 18.73±2.052）中浓度CQ 组 85.13±2.462） 14.77±1.932）高浓度CQ 组 65.87±3.983）4） 29.05±2.343）4）

三、CQ 对HUVEC 凋亡相关蛋白的影响

通过蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白发现，与对照组相比，LPS 刺激后BAX、 裂解的胱天蛋白酶3 蛋白的表达升高，BCL-2 蛋白的表达有所降低，BCL-2/BAX 蛋白比值明显降低（P＜0.05）；给予CQ处理后，低、中浓度CQ 逆转了LPS 对上述蛋白的作用，导致BCL-2/BAX 蛋白比值升高（P＜0.05），裂解的胱天蛋白酶3 蛋白表达降低（P＜0.05），但高浓度CQ 作用后，BCL-2/BAX 蛋白比值较LPS 组升高（P＞0.05），裂解的胱天蛋白酶3 蛋白表达较LPS 组升高（P＜0.05）（见图1、表2）。

图1 不同浓度CQ 对BCL-2、BAX、裂解的胱天蛋白酶3表达的影响

表2 不同浓度CQ 对凋亡相关蛋白的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影响（均n=5，±s）

表2 不同浓度CQ 对凋亡相关蛋白的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影响（均n=5，±s）

1）：与对照组比较，P＜0.05；2）：与LPS 组比较，P＜0.05；3）：与低浓度CQ组比较，P＜0.05；4）：与中浓度CQ 组比较，P＜0.05

组别 BCL-2/BAX 裂解胱天蛋白酶3 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ对照组 1.73±0.08 0.94±0.11 0.79±0.11 LPS 组 0.61±0.061） 1.45±0.041） 0.89±0.16低浓度CQ 组 1.52±0.072） 1.13±0.082） 0.81±0.07中浓度CQ 组 1.42±0.062） 1.03±0.072） 1.00±0.17高浓度CQ 组 0.79±0.04 1.59±0.052）3）4） 2.13±0.142）3）4）

四、CQ 对HUVEC 自噬相关蛋白LC3 的影响

通过蛋白质印迹法检测LC3 蛋白发现，与对照组相比，LPS 刺激后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值无明显变化（P＞0.05）；与LPS 组相比，低、中浓度CQ 对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也无明显作用，而高浓度CQ 作用后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高（见图2、表2）。

图2 不同浓度CQ 对自噬相关蛋白LC3 表达的影响

讨 论

脓毒症是急危重症医学常见病，其发病率高、致死率高，是全球主要的卫生健康问题[9]。 研究发现， 内皮细胞损伤是导致脓毒症发生器官功能障碍的中心环节， 而细胞凋亡是其中的重要机制之一[2]。 本研究以LPS 诱导内皮细胞凋亡， 结果表明LPS 可以抑制内皮细胞活力， 增加内皮细胞的凋亡，与之前的一些研究结果[10-11]一致，因此调控内皮细胞凋亡可能对改善脓毒症导致的重要器官损伤具有一定的重要意义。

CQ 是一种经典的抗疟疾药，由于其抗炎、免疫调节、抗肿瘤等特性不断被挖掘，逐渐应用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和肿瘤等疾病治疗中[12]。近年来一些研究表明，CQ 通过抑制炎症因子的释放在脓毒症相关的体内和体外试验中有一定的疗效，但CQ 对脓毒症所致内皮细胞损伤的作用并不明确[13]。

本研究应用CQ 干预LPS 诱导的细胞损伤模型，观察不同浓度CQ 对细胞活力和细胞凋亡的影响。结果表明，CQ 在低、中浓度时提高细胞活性，同时降低LPS 诱导的细胞凋亡；在高浓度时则降低细胞活性即抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。 在百草枯诱导肺损伤的体外模型中， 研究结果与本研究类似，在较低浓度时CQ 的应用能够抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，随着CQ 浓度增高，细胞凋亡增多[14]。此外，在癌症治疗中，高浓度CQ 常用来诱导肿瘤细胞凋亡。 因此CQ 对细胞凋亡的作用与其应用剂量有关。

细胞凋亡主要有外源性死亡受体途径、内源性线粒体途径和内质网途径[15]。 研究表明，CQ 能够改变溶酶体的通透性参与线粒体凋亡途径[16]，因此本研究进一步研究了CQ 对线粒体途径凋亡相关蛋白表达的影响，结果发现，低、中浓度CQ 能够提高BCL/BAX 比值，降低裂解的胱天蛋白酶3 的表达，表明CQ 在低、 中浓度时通过线粒体途径来拮抗LPS 诱导的细胞凋亡；而CQ 在高浓度时BCL/BAX比值升高不明显， 裂解的胱天蛋白酶3 的表达升高，表明高浓度时CQ 主要通过非线粒体途径激活胱天蛋白酶3 途径诱导内皮细胞凋亡。

LC3 是常用的自噬标志物， 存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ2 种蛋白状态[17]。 研究显示CQ 可以影响LC3 蛋白的表达而影响自噬[18]。 本研究进一步研究了CQ 在脓毒症状态下对于自噬的影响， 发现低、中浓度CQ 作用时，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白无明显变化， 高浓度CQ 作用时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，LC3-Ⅱ蛋白有明显的累积，表明CQ 在较低浓度时不影响自噬，而高浓度时CQ 提高LC3-Ⅱ蛋白的表达，发挥促进基础水平自噬的功能。 综合本研究结果提示，引起自噬激活的CQ 浓度高于对细胞产生保护作用的CQ 浓度，因此，CQ 在低、中浓度时改善LPS 诱导的内皮细胞损伤主要通过抑制凋亡途径实现，与自噬无关；本研究结果与文献报道[19]类似，脓毒症内皮细胞损伤时主要表现为细胞凋亡增加， 而非自噬增加。 CQ 在高浓度时加重LPS 诱导的内皮细胞损伤可能和促进细胞自噬、激活凋亡途径有关。

综上所述, 不同浓度的CQ 对LPS 诱导的内皮细胞损伤有不同的作用：低浓度时CQ 能抑制凋亡途径减少内皮细胞凋亡；高浓度时促进自噬，激活凋亡途径促进内皮细胞凋亡。 当然CQ 在不同浓度时产生不同作用的机制仍不是很明确，有待进一步研究。