DSP 复合杂合基因突变与扩张型心肌病的发生有关

姜逊渭， 王健怡， 肖婷婷， 谢利剑， 侯翠兰， 张永为

（上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院心内科，上海 200062）

扩张型心肌病 （dilated cardiomyopathy, DCM）是一种原因未明的原发性、严重影响患儿健康的心肌疾病， 5 年病死率约为15%～50%[1]。 美国流行病学研究表明DCM 患病率为36.5/10 万[2]。 2001—2002 年，我国调查发现，DCM 患病率约为19/10 万[3]，DCM 等心肌病给社会、 家庭均带来沉重的经济负担。基于遗传学特点将DCM 分为原发性和继发性两大类[4]。 DCM 的致病原因错综复杂，尤其是特发性DCM，无法判断致病原因，难以有效控制病情进展。目前，除心脏移植术外，尚无根治方法。 其次，儿童DCM 的发病率暂无统计数据， 虽然DCM 总的发病率较低，但我国人口基数大，经济和医疗水平分布极其不均衡，推测儿童DCM 发病率不容乐观，因此较早地精准诊断疾病的致病原因，显得颇为重要。

DCM 遗传学方面的发病机制取得了令人欣喜的成果，发现了如肌小节相关基因、细胞骨架基因、核膜相关基因等突变[5]。 对特发性DCM 患儿家系分析发现， 其中约5%～10%呈家族性，40%～50%DCM 与遗传因素有关[6-7]。目前，对家族性DCM 连锁分析，定位了26 个连锁染色体区段，发现30 多个致病基因，如心肌肌节蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、Z 盘蛋白基因、钙调控蛋白基因等[8-9]。常见致病基因有核纤层蛋白A（lamin A，LMNA）、肌球蛋白重链7（myosin heavy chain 7，MYH7）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T type 2, TNNT2）、心脏钠通道（cardiac sodium channel，SCN5A）、肌球蛋白结合蛋白C（myosin binding protein C 3，MYBPC3）等。其中伴有转导障碍的绝大多数与LMNA 基因突变有关[5,10]。 桥粒斑蛋白（desmoplakin, DSP）基因是第一个被发现和常染色体显性致心律失常性右心室心肌病（arrhythmic right ventricular cardiomyopathy,ARVC）相关的基因。研究表明DSP 突变导致PG 核转位并抑制Wnt/p-联蛋白（catenin）信号，导致ARVC，DSP 可以调控心脏内的间隙连接和钠离子通道，从而影响桥粒并致病。

最新美国心脏病学会基金会（American College of Cardiology Foundation，ACCF）/美 国 心 脏 协 会（American Heart Association，AHA）的诊治指南，对于DCM 患者建议进行致病基因的全面筛查[11-12]。本研究利用全外显子测序 （whole exome sequencing,WES），对一个DCM 家系行致病基因筛查，综合分析WES 应用于DCM 遗传检测的可行性，并对筛查出的致病基因进行分析，功能预测，深入研究DCM的发病机制，对临床医师精准判断、诊治遗传性心肌病提供理论依据。

资料和方法

一、研究对象

2018 年11 月，对我院就诊患儿一核心家系进行分析。先证者是4 岁男性患儿，因发现“心脏超声异常3 个月余”来本院就诊，按照小儿DCM 的诊断流程[4,13]，初步诊断为DCM，患儿接受相关药物治疗。

二、一般临床资料

收集该患儿的临床资料，包括体格检查、发病年龄、超声心动图及心电图。 本研究获我院伦理委员会批准（伦理号为：2017R047-E02）。 患儿父母签署知情同意书。

三、全外显子组测序

采集所有研究对象的外周血2 mL， 抽提血液基因组DNA， 使用Roche Nimblegen Seq Cap EZ Exome V3（罗氏）试剂盒，对患儿及其父母的样本基因外显子编码区及其上下游捕获并扩增， 建库（此方法只适用于基因外显子编码区及其上下游5 bp 范围内的点突变和15 bp 以内的微小插入/缺失检测），利用Hiseq 2500 高通量平台测序，每个样品产生15 bp 的配对末端测序数据，样本测序深度平均100×， 核心目标序列区域的测序深度不低于20×。

四、信息学分析

比对参考基因组， 获得比对到基因组上的Unique mapped reads，并对数据进行质控、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）检测、InDel 检测、注释。 测序完成后，利用自主开发的软件分析过滤数据， 使用BWA-0.7.10 软件与人类基因组数据库进行比对；GATK 软件识别并过滤单碱基变异、插入缺失变异；利用数据库如千人基因组、ExAC、HGMD、ClinVar、gnomAD、OMIM 和 本 院 的370 例样本的WES 数据库等进行注释。 利用SIFT、Mutation Assessor、Polyphen2、Mutation Taster、HSF 等软件预测候选基因的致病性。 利用NCBI 网站 （网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene），比对突变位点氨基酸序列的同源性。根据数据库注释、软件预测及其临床表型，对致病突变位点进行筛选过滤。 得到候选基因突变列表（Candidates.xlsx），对基因突变列表按照美国医学遗传学与基因组学学会的遗传变异分类标准指南解释[14]。 对遗传变异经过以下步骤进行筛选：优先关注公共数据库中收录的可能与疾病相关的遗传变异， 如小的插入/缺失（indel）、典型的剪切位点改变及错义变异；根据正常人数据库过滤＞5%的SNP 突变[已知的最小等位频率 （minor allele frequency, MAF）≥5%的致病性变异除外]； 筛选过滤掉无义突变、 移码突变、可变剪切及错义突变等因素；再与HGMD、Clin-Var 等数据库收录的遗传变异进行比对。

五、Sanger 测序

对患儿、 其父母相关基因突变所在区域进行PCR 扩增，PCR 产物送苏州泓迅生物科技有限公司进行Sanger 测序。 具体步骤为从NCBI 网站下载DSP 基因DNA 全序列（位点1：NM_004415.2，位点2：NM_004415.2, Genebank ID: 1832）；Primer 5 软件设计PCR 引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；利用PCR 试剂盒（天根生化科技有限公司） 进行扩增。 位点1 引物序列：F: 5’-AACCTGCAGAGAACACCAG-3’；R: 5’-ACGATTAAGCCTAGTACCCAT-3’。 位点2 引物序列：F: 5’-CCACCATCAAGGAGATATCCA-3’；R: 5’-CTCTGTTCGCATCTGAGTGAC-3’。 反应条件均为：95 ℃预变性5 min； 然后94 ℃变性25 s，56.5 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；最后72℃延伸5 min。 胶回收、纯化，采用正向测序，分析基因序列，然后与标准序列进行比对分析。

结 果

一、先证者临床资料

先证者（Ⅲ-1）为男性患儿（见图1），超声心动图检查提示：左心房、左心室显著增大，左心室壁无肥厚，左心室呈球样扩张，室间隔及左心室后壁运动幅度减低，心肌收缩时间不协调；左心室舒张末期内径为4.61 cm，左心室收缩末期内径为4.25 cm，左心室收缩功能减低（左心室射血分数为15%，左心室缩短分数为7%）（见图2A）。 二尖瓣瓣叶无明显增厚卷曲，活动幅度减小，轻中度反流，三尖瓣轻度反流[压差34 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）]。 左右冠状动脉开口于左右冠状动脉窦， 卵圆孔未闭，未见明显心包积液，肺动脉高压（见图2B）。 心电图提示：窦性心动过速，心房肥大，左、右心室肥大可能，T 波改变（Ⅰ、V6导联T 波倒置）（见图3）。 心肌标志物肌钙蛋白I 0.53 μg/L （＜0.3 μg/L）， 肌红蛋白45.90 μg/L（0～75 μg/L），N 末端脑钠肽15 000.00 ng/L（0～250 ng/L），肌酸激酶117 U/L（20～180 U/L），肌酸激酶-MB 同工酶22 U/L（0～25 U/L）。

图1 DCM 家系图

二、致病基因检测

通过WES 筛查出3 个致病基因， 分别是DSP（NM_004415.2）、DSP（NM_004415.2）、GALNS（NM_000512） 和CDH23 （NM_022124）（见表1）。 查阅OMIM 数据库， 根据数据库和临床表型分析，仅DSP 基因突变与临床表型关联。 WES 测序发现先证者携带DSP 基因杂合突变c.939+1G＞A， 该突变位于DSP 基因第7 内含子，患儿母亲在该位点呈现杂合突变，父亲无突变（见图4A、B）；先证者同时携带DSP 基因杂合突变c.4198C＞T，该突变位于DSP第23 外显子上，患儿父亲在该位点呈现杂合突变，母亲无突变（见图4C）。 DSP 基因c.4198C＞T 突变导致精氨酸突变为缬氨酸，Clustal X 分析DSP 基因1 400 位氨基酸残基的保守性， 发现其在不同物种之间具有高度保守性（见图4D）。

图2 DCM 患儿M 型超声心动图

图3 患儿12 导联心电图

表1 WES 检测中发现的与临床表现无明确关联的基因突变情况

图4 DCM 患儿及其家系Sanger 测序图

讨 论

DCM 是一种常染色体显性遗传病， 主要由编码肌小节蛋白的基因发生突变。 明确DSP 基因突变所致DCM 的临床特点， 对于此类患儿的早期精准判断和提高其预后具有重要意义。 DCM 致病基因较多，Sanger 测序等传统的筛查方法耗时长并且费用较高，存在一定的缺陷。 另外，DCM 的遗传异质性限制了基因筛查在判断DCM 预后和危险分层中的应用。本研究中通过生物信息学分析，数据库注释，软件预测和临床表型分析，对一个DCM家系进行致病基因的筛查， 发现患儿的表型可能与DSP 基 因c.939+1G＞A 和c.4198C＞T 突 变 有关。 OMIM 数据库中已经收录DSP 基因的c.939+1G＞A 和c.4198C＞T 为有害突变，DSP 可能是DCM的致病基因。

心脏结构和功能的完整性主要依靠桥粒的支持作用，5 种主要的桥粒蛋白分别为桥粒珠蛋白、血小板亲和蛋白2（plakophilin 2，PKP2）、桥粒芯糖蛋白-2、DSP 和桥粒芯胶蛋白。 其中DSP 的N 末端与PG 及PKP2 连接，C 末端与结蛋白中间纤维丝连接[15]。 近年来有报道DSP 基因第23 外显子发生纯合子无义突变， 截断了DSP 的C 末端与结蛋白相结合的较大片段，引起DCM、皮肤角化和头发逢乱等临床综合征[16]。 DSP 基因中导致氨基酸链合成提前终止的突变更多，这类突变患者多表现为显著的左心室射血分数降低，影像学上有更大范围的左心室延迟增强，心电图表现为频发的侧壁T 波倒置和右束支传导阻滞型室性心动过速[17]。 尽管已有文献报道DSP 基因的c.939+1G＞A 发生突变与疾病有关， c.4198C＞T 突变与早发性心力衰竭、 脱发和皮肤异常有关，但是本例患儿DSP 基因突变与全心增大、左心功能降低的疾病表型紧密相关。

本研究通过外显子捕获技术富集基因组DNA，同时应用SIFT、HSF、Poly Phen 软件，预测基因突变的致病性，分析临床表型的同时，能够较准确地找出相关的致病基因。 WES 提示与心肌病紧密相关的DSP 基因突变， 同时也提示GALNS（NM_000512）c.1462G＞A 突变与黏多糖贮积症，CDH23 （NM_022124） c.4762C＞T 与耳聋/Usher 综合征有关， 高通量测序提示该患儿潜在的风险。WES 发现先证者携带DSP 基因杂合突变c.939+1G＞A，患儿母亲在该位点呈现杂合突变，父亲无突变； 先证者同时携带DSP 基因杂合突变c.4198C＞T，患儿父亲在该位点呈现杂合突变，母亲无突变。该突变导致精氨酸突变为缬氨酸，Clustal X 分析DSP 基因1 400 位氨基酸残基的保守性发现，其在不同物种之间具有高度保守性。 WES 等二代测序能快速地、准确地捕获基因序列信息，快速精准地了解遗传性疾病，通过对家族相关基因和数据库基因比对分析，能够较准确地发现致病基因。 深入分析DCM 的发病机制，提供新的治疗靶点，对患者进行早诊断、早治疗，将大大改善DCM 患者的预后。

以上研究体现心肌病遗传的异质性，对致病基因突变进行分析， 深入研究心肌病的发病机制，为临床医师精准判断、诊治遗传性心肌病提供理论依据。 精准医学前景广阔，在心血管领域大有可为[18]。通过WES 二代测序，发现患者基因突变的位置，并通过后续的生物信息学分析，对于精准治疗心肌病具有重要意义。 其次，基因检测有益于家族性DCM患儿明确疾病的遗传机制，对于家系其他成员的早期诊断具有重要意义，对于突变携带者，有针对性早期干预、治疗、生育前的遗传咨询。 因此，对于家系中的携带者，应告知其本人及家属存在的潜在风险，预防并定期随访，针对心功能出现的异常情况及时给予干预。