新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究

薛新梅，齐萌，陶大勇

（塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300）

棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病，是由棘球绦虫(Echinococcus)的幼虫棘球蚴(Echinococcus cyst)寄生于人畜体内引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。目前公认的棘球属绦虫有4个种，而我国主要是细粒棘球绦虫（E.granulosus）[1]。该病呈世界分布，广泛流行于亚洲、拉丁美洲、南欧、大洋洲及冰岛等畜牧业发达的国家及地区，主要以发展中国家流行强度较高[2,3]。在我国主要以新疆、云南、陕西、青海、甘肃、西藏、宁夏、内蒙古和四川西部等地区流行为主，严重危害畜牧业生产和人类健康，造成巨大的经济损失[4,5]。近年来由于分子生物学在寄生虫领域的应用，能够在基因水平上进行细粒棘球蚴病的诊断。应用PCR测定线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome c oxidase subunit 1,COx1）基因的序列可用于鉴定细粒棘球蚴的基因变异，并可作为细粒棘球蚴进化变异的指示器，因此许多学者常常把其作为细粒棘球蚴的基因分型、进化关系分析和重新分类等的重要依据[6,7]。

和静县作为畜牧业大县，牲畜存栏104.3万头（只），其中羊存栏88.5万只，已成为新疆现代畜牧业的重要组成部分，因此肝包虫的防控显得日益重要。为了弄清新疆和静县绵羊细粒棘球蚴病的感染情况及其流行株基因分型，笔者于2019年9～10月对来源于新疆和静县屠宰场1 115只1岁以上绵羊采取剖检的方法进行了细粒棘球蚴病的感染情况调查和统计，并对随机分离的10个包囊病灶利用线粒体细胞色素氧化酶基因1（mtCO1）通过PCR扩增、克隆测序的方法进行了细粒棘球蚴流行株的基因分型，以确定和静县绵羊细粒棘球蚴的感染情况和主要流行基因型，为该地区绵羊细粒棘球蚴病的科学防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 取样地区概述

和静县隶属于新疆巴音郭楞蒙古自治州，位于巴音郭楞蒙古自治州西北部，下辖1个区公所（巴音布鲁克区公所）、4个镇、8个乡，其中农区有5个乡镇、牧区有7个乡镇，拥有草场面积达214.79万hm2，是全国面积最大的高山天然草原。

1.2 病例来源

来源于2019年9～10月和静县屠宰场屠宰绵羊（主要来自和静县农区和牧区）。

1.3 主要仪器及试剂

离心机和PCR仪，购自Eppendorf中国有限公司；JY系列电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像分析系统，购自BioRad公司；组织DNA提取试剂盒、Taq plus DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖凝胶回收试剂盒、琼脂糖、DNAMarker及其他生化试剂，购自上海生物工程公司；pMD18-T载体，购自大连TaKara公司；大肠杆菌 (E.coli) DH5α感受态细胞，石河子大学寄生虫实验室提供。

1.4 病原学检测

进行剖解检查：待羊屠宰后，取出肝、肺等脏器，经肉眼观察和触摸仔细检查肝脏和肺脏表面有无棘球蚴包囊，并记录绵羊的来源地和细粒棘球蚴的感染数，然后将带有棘球蚴包囊的脏器带回实验室。

1.5 病料的采集及DNA的提取

从和静县屠宰场收集感染细粒棘球蚴绵羊的脏器，以一只羊肝脏或肺脏脏器的包囊为一份阳性病料，用5mL注射器共抽取10份感染病料囊液于1.5mL EP管中，8 000r/min离心8min，将上清液置于-20℃保存，将含有原头细粒棘球蚴的样品用TIANamp UenomicDNA Kit提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.6 PCR扩增及测序

以提取的基因组DNA为模板，依据文献报道的目的基因进行测试[8]，引物由北京六合华大基因生物公司合成。首先扩增线粒体细胞色素氧化酶基因1（mtCO1）。mtCO1上游引物：5'- TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3'，mtCO1下游引物：5'-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3'；采用20μL反应体系：ddH2O 9μL，2×PCR Mix 8μL，模板2μL，上、下游引物各0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸35s，38个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.3%琼脂糖凝胶电泳检测。然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收PCR产物中的目的片段，并与载体pMD19-T在4℃条件下过夜连接；12h后将产物转化于E.coliDH5α感受态细胞中。在氨苄青霉素平板上进行筛选，然后做菌液PCR反应，进一步筛选验证。将验证正确的重组载体产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序，以确定在新疆和静县流行的细粒棘球蚴的基因型。

2 结果与分析

2.1 绵羊细粒棘球蚴感染情况

经对2019年9～10月和静县屠宰场屠宰的1 115只绵羊细粒棘球蚴病的感染情况进行调查和统计，发现有88只绵羊脏器表面有棘球蚴包囊，感染率为7.89%，其中来自农区的绵羊感染率为3%（10/331），来自牧区的绵羊感染率为9.9%（78/784），见表1。

表1 绵羊细粒棘球蚴的感染情况

2.2 细粒棘球蚴mtCOl基因的PCR扩增结果

通过mtCO1引物PCR扩增后的目的基因产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获得特异性的PCR产物，片段长度为446bp（图1）。克隆转化后，随机挑取单菌落，做菌液PCR筛选验证，成功得到阳性转化子（图2）。

图1 细粒棘球蚴mtCO1基因的PCR扩增结果

图2 菌液PCR扩增结果

2.3 细粒棘球蚴mtCO1基因的序列比对分析

经测序，新疆和静县绵羊细粒棘球蚴线粒体细胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的片段长度为446 bp。对10个绵羊细粒棘球蚴流行株的mtCO1基因序列通过NCBI中的Blast功能比对，发现与登录号为KT446001.1、KT968706.1、HF947595.1的同源性为99%～100%，证实新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因型为G1型。

3 讨论

细粒棘球绦虫自1905年我国青岛首次报道以来，国内外学者对其感染情况进行了大量调查研究。Kamal等于2011年对非洲苏丹地区待屠宰的4 378只绵羊的细粒棘球蚴感染情况进行了调查统计，结果显示有26只绵羊感染，感染率为0.6%[9]。宋雪梅于2013年8～11月对新疆塔城地区沙湾县屠宰场屠宰的1 040只绵羊细粒棘球蚴病感染情况进行了调查统计，结果显示绵羊棘球蚴平均感染率为4.3%[10]。本研究通过对和静县源自农区和牧区的绵羊进行细粒棘球蚴感染情况调查统计，发现来自牧区的绵羊细粒棘球蚴病感染率为7.89%，明显高于农区感染率的3%。分析其原因，可能与绵羊饲养方式有关。根据走访调查发现，牧区多以放牧的形式进行饲养，由于羊群数量庞大，常伴有牧羊犬看护，牧羊犬往往造成驱虫给药预防不及时，再加上防控意识缺乏，常有牧民把感染包虫囊的内脏给牧羊犬吞食；最后由于放牧区域经常转场，加大了其传播风险。而农区多以圈养形式饲养，降低了以上感染风险。针对这一现状，建议采取以下措施来控制和静县牧区包虫病的流行：①加强牧区包虫病的预防工作；②对包虫病感染脏器进行无害化处理，严格控制其流向牧羊犬；③定期对牧羊犬进行驱虫，并对粪便进行深埋处理；④加强和普及绵羊细粒棘球蚴的疫苗免疫工作，并及时做好监测；⑤控制牧羊犬的数量。由于犬作为细粒棘球绦虫的终末宿主，粪便中的虫卵量很大，易污染牧场环境，因此应将和静县包虫病的防控重点放在牧羊犬数量的控制上，从而有效控制包虫病在人畜间的流行[11]。

养羊业是新疆和静县畜牧业的主要经济支柱，由于草场资源丰富，多选择放牧的形式饲养，使该地区成为人畜包虫病的高发区。近些年来，国外学者借助分子生物学方法以及细粒棘球蚴绦虫基因组的特征，把其分为10种（G1-G10），其中G1为最常见的绵羊株[12,13]。Vural等对土耳其绵羊源细粒棘球蚴分离株样品进行扩增测序，发现G1型基因广泛存在于绵羊体内，且同时发现G3型[14]。张学勇等对青海天峻地区16份绵羊源和2份人源细粒棘球蚴分离株样品进行COx1基因PCR扩增、测序，发现人和绵羊细粒棘球蚴流行株的基因型均属于G1型[15]。本研究对源自新疆和静县农区和牧区的10份绵羊细粒棘球蚴分离株样品进行了线粒体细胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的扩增、克隆测序，通过NCBI中的Blast功能比对发现，和静县绵羊细粒棘球蚴流行株均为G1型，未发现其他型，这可能与采样基数偏少有关。确定和静县绵羊细粒棘球蚴流行株的基因型，为该地区绵羊包虫病防控工作和分子流行病学调查提供了科学依据以及数据支持。