薄壳山核桃种仁成熟过程中生育酚动态变化研究

许梦洋，罗会婷，贾晓东*，翟 敏，莫正海，贾展慧，宣继萍，张计育，郭忠仁

（1 江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014；2 江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014）

薄壳山核桃 ［Carya illinoinensis（Wangech.）K.Koch］种仁含油量高，油脂富含不饱和脂肪酸，如油酸（Oleic acid）为49.0%～76.5%，亚油酸（Linoleic acid）为13%～40%；而饱和脂肪酸含量很低（6%～17%）[1，2]。日常食用这种脂肪酸比例的油脂对保护心脏健康具有重要作用[3,4]。此外，薄壳山核桃还因具有良好的抗氧化性而备受关注。Wu[5]等（2004）测定美国市场上常见的100余种食品的抗氧化性，结果显示，薄壳山核桃的抗氧化性在干果中排名第一，显著高于其他干果。薄壳山核桃种仁的强抗氧化性主要来源于生育酚（Tocopherol）、甾醇（Phytosterol）及多酚（Polyphenol）等活性成分[6～10]。其中生育酚，又名维生素E（Vitamin E），是薄壳山核桃种仁中的主要抗氧化活性成分[11]，其主要功能就是作为抗氧化剂抑制多不饱和脂肪酸的氧化[12]。日常食用富含生育酚的食品可预防心脑血管疾病、阿尔茨海默症，缓解前列腺癌和乳腺癌症状。生育酚还具有一定的抗炎作用[13]。

前人已对薄壳山核桃中的生育酚进行一些研究。然而，这些研究主要集中在成熟种仁中的生育酚含量测定及不同品种比较上，关于生育酚在种仁发育早期的含量及动态变化却鲜有报道，这不利于对薄壳山核桃的进一步研究和开发利用。前期我们已经对薄壳山核桃果实的形态[14]、含油率、蛋白质、矿质元素等[15]的动态变化规律进行研究。薄壳山核桃种仁富含生育酚，具有良好的抗氧化能力，如能明确其随果实发育成熟的变化规律，必将对今后的果实品质形成机理研究和品质育种工作有重要的指导意义。基于此，本文选择5 个薄壳山核桃主栽品种，对果实进行动态取样，测定油中α-、γ-、δ-生育酚含量动态变化，以期为今后薄壳山核桃果实品质研究和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验于2016年在中国江苏省南京市六合区雄州镇龙虎营村江苏省中国科学院植物研究所果树科学研究项目组基地进行。供试薄壳山核桃树龄为7年生，品种有‘波尼’‘斯图尔特’‘威奇塔’‘金华’和‘绍兴’，株行距为6.0 m×8.0 m。每品种选取生长发育良好、树势相对一致的6 株，2 株1 小区，3 次重复。采样时间为盛花后115～165 d，每隔10 d 取样1 次。样品取自长势中庸的结果枝，于每株树东、南、西、北4 个方向分别取样，每个方向取健康、无病虫害果实2～6 个，每株共取果实8～24 个，果实采样量随果实发育逐渐减少。取样后迅速用冰盒带回实验室，放入-20 ℃冰箱过夜后，人工剖开取种仁，-70 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 试剂及仪器

α-生育酚（CAS：59-02-9，LOT：MKBS2473V，纯度＞96%）、γ-生育酚（CAS：54-28-4，LOT：SLBV1421，纯度＞96%）、δ - 生育酚（CAS：119 -13 -1，LOT：SLBL6250V，纯度＞90%），均购自Sigma-Aldrich公司。正己烷：AR级；甲醇：AR级；甲醇：色谱级。Hettich离心机（Andreas Hettich GmbH ＆ Co.KG,Germany）。Agilent 1100液相色谱仪，紫外检测器（VWD）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）。

1.3 色谱条件

色谱条件参考Villarreal-Lozoya 等（2007）报道，略有改动。流动相：甲醇/水（97/3，v/v）；柱温35°C；流速1 mL/min；检测波长298 nm；进样量10 μL。

1.4 供试液制备

采用索氏提取法提取油脂，提取溶剂为正己烷[16]。油脂中维生素E的提取参考Villarreal-Lozoya等[17]的方法，略加改动。具体为称取索氏提取法得到的油脂约0.5 g，置于15 mL离心管中，加入2 mL甲醇，涡旋1 min；混合液6 000 rmp 转速离心5 min；收集上清液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，-20 ℃储存备用。

1.5 标准曲线绘制

精密称取α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚对照品，甲醇定容分别配成0.2、0.005及1.00 mg/mL的原液备用。逐级稀释后依照1.3项下条件进样测定，根据峰面积绘制标准曲线分别为：α-生育酚（y=400.21x+0.581 2；R2=0.999 9）；γ-生育酚（y=518.24x-3.307 9；R2=0.999 9）；δ-生育酚（y=553.17x-0.352 3；R2=0.999 9），结果用mg·kg-1表示，即每千克油脂中生育酚的含量。

1.6 方法学研究

稳定性实验取‘波尼’165 d 样品供试液，分别在0、4、8、12、24 h 检测；精密度实验取‘波尼’165 d 样品供试液，连续进样5 次检测；重复性实验取‘波尼’165 d 样品5 份，按供试品溶液制备方法制备检测。结果各实验均RSD ＜3% ，说明供试品溶液在24 h 内稳定，精密度与重复性符合要求。

1.7 数据处理

数据处理及动态变化图绘制采用Excel 软件，相关性分析用SPSS 软件（18.0） 处理，主成分分析应用SIMCA-P 软件（12.0）进行。所有分析均重复3 次及以上，结果用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 薄壳山核桃种仁中3 种生育酚的动态变化规律

自然界存在α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三酚（Tocotrienol）8 种形式[1]，薄壳山核桃种仁中含量较高的是α-、γ-、δ-生育酚3 种[18]。从薄壳山核桃种仁的液相色谱图（图1）中可看出，3 种生育酚按照出峰顺序依次为δ-生育酚（9.5 min）、γ-生育酚（10.9 min）和α-生育酚（12.4 min）。

γ-生育酚在5 个品种中均为发育早期含量最高，之后逐渐降低（图2），成熟样品中γ-生育酚的含量与发育早期样品相比显著降低（p ＜0.05）。其中‘威奇塔’含量最高（191.80 mg·kg-1，115 d），‘绍兴’含量最低（66.05 mg·kg-1，145 d）。成熟样品中（盛花后155d），γ-生育酚的含量从高到低依次为‘金华’（123.60 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（115.91 mg·kg-1，155 d）、‘波尼’（95.85 mg·kg-1，155 d）、‘斯图尔特’（78.37 mg·kg-1，165 d）、‘绍兴’（71.87 mg·kg-1，165 d）。

δ-生育酚的含量在发育早期较高，‘斯图尔特’在115 d含量最高，其他4个品种均在115 d含量最高，之后含量均逐渐降低（图3）。其中‘金华’115 d样品含量最高（119.61 mg·kg-1），155 d样品含量最低（4.59 mg·kg-1）。成熟样品中，δ-生育酚的含量从高到低依次为‘绍兴’（14.71mg·kg-1，165 d）、‘斯图尔特’（11.61 mg·kg-1，165 d）、‘波尼’（10.20 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（9.94 mg·kg-1，155 d）、‘金华’（4.59 mg·kg-1，155 d）。

各品种种仁中α-生育酚的含量也是在发育早期最高，之后迅速降低（图4）。其中‘金华’115 d 样品含量最高（73.92 mg·kg-1），‘波尼’145 d样品含量最低（1.40 mg·kg-1）。成熟样品中，α-生育酚的含量从高到低依次为‘斯图尔特’（3.08 mg·kg-1，165 d）、‘波尼’（2.74 mg·kg-1，155 d）、‘绍兴’（2.16 mg·kg-1，165 d）、‘金华’（1.79 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（1.61 mg·kg-1，155 d）。

2.2 薄壳山核桃种仁总生育酚的动态变化规律

3 种生育酚的总含量总体呈现与单个生育酚类似的动态变化规律（表1）。发育早期最高，之后随着果实的发育呈现降低的趋势，成熟期含量与115 d 比较显著降低（p ＜0.05）。其中‘金华’115 d 样品总生育酚含量最高，绍兴155 d 样品含量最低。成熟样品中，总生育酚的含量次序与γ-生育酚一致，为‘金华’‘威奇塔’‘波尼’‘斯图尔特’‘绍兴’。

2.3 薄壳山核桃不同品种生育酚含量的比较

从图2～图4中可以看出，不同品种α-、γ-、δ-生育酚的含量存在显著差异，且在种仁发育早期更明显，至发育晚期品种间的差异降低。不同品种的总生育酚在种仁发育早期差异也较大（表1），115 d 种仁含量最高的‘金华’为349.38 mg·kg-1，比含量最低的‘波尼’（196.10 mg·kg-1）高78%；而到了成熟期，含量最高的‘金华’（155 d）为129.98 mg·kg-1，比含量最低的‘绍兴’（165 d，88.74 mg·kg-1）高46%。从图5中可以更加直观地看到，不同品种间存在显著差异，尤其是发育早期，点与点之间距离较远，而到发育后期点与点间的距离明显靠近，说明差异较小。单独观察每个品种，可看出随着果实发育，不同发育期样品点呈现出明显的动态发育轨迹，各品种均存在类似的动态发育轨迹，说明生育酚随薄壳山核桃种仁发育逐渐变化。

表1 薄壳山核桃种仁中总生育酚含量

2.4 生育酚指标间的相关性

综合各品种各发育时期样品数据对各生育酚指标进行相关性分析（表2），结果显示各生育酚指标间均极显著相关，其中γ-生育酚与总生育酚的相关系数最大，α-生育酚与δ-生育酚的相关系数最小。

表2 各生育酚指标间的相关性

3 讨论

生育酚作为一种天然抗氧化剂，能够发挥类似维生素E 的功效[19]，防止多不饱和脂肪酸氧化，对人类健康具有积极功效。然而截至目前，薄壳山核桃种仁生育酚含量的动态变化规律报道很少。Bouali 等[12]研究了突尼斯种植的薄壳山核桃‘Burkett’品种种仁生育酚变化情况，结果显示α-、γ-、δ-生育酚含量均在发育早期含量最高，随种仁发育快速下降，该结果与本实验得出的变化规律一致。Rudolph 等[20]用薄层板分离美国产薄壳山核桃‘Stuart’和‘Schley’品种种仁的生育酚，硅烷化后气相测定含量，结果显示两个品种的生育酚均随种仁发育快速下降。这些报道及本实验的研究都表明，生育酚含量在薄壳山核桃种仁发育早期较高，并随种仁发育快速下降。如δ-生育酚，尽管在‘金华’成熟样品中其含量仅为4.59 mg·kg-1，但在发育早期样品中可达到119.61 mg·kg-1。说明3 种生育酚在薄壳山核桃发育早期被大量合成，之后随着种仁油脂含量的增多浓度被逐渐稀释，或随着种仁发育转化为其他产物，或两种原因共同存在。

薄壳山核桃种仁成熟过程中生育酚含量的变化与饱和脂肪酸含量的变化高度一致，都是在种仁发育早期较高，随发育快速降低，并在成熟后略微上升，而与单不饱和脂肪酸——油酸的含量变化规律刚好相反[15]。薄壳山核桃种仁发育早期的高生育酚含量可能与脂肪酸的高不饱和度密切相关[21]。随着种仁发育成熟，种仁中的多不饱和脂肪酸含量快速下降，从而也许间接导致生育酚含量也下降。生育酚含量的下降还可能与对羟苯基丙酮酸双氧化酶（p-hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD）活性的降低有关。HPPD 是生育酚代谢途径的关键酶[22]，多项研究表明，HPPD 活性是植物体生育酚合成的关键调控因素，HPPD 活性降低会影响2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol（MPBQ）和2,3-dimethyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol（DMPBQ）的合成和积累，从而影响生育酚的合成和积累。Tsegaye 等[23]曾报道，过量表达HPPD 会引起拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片和种子中总生育酚含量的上升。

与其他干果相比，薄壳山核桃种仁生育酚含量较高。在与杏仁、巴西坚果、腰果、栗、松子、榛子、开心果、澳洲坚果、核桃和花生的比较中，薄壳山核桃种仁油的γ-生育酚含量排名第二[8]，为47.29mg·100g-1。另一个对英国市场上的巴西坚果、薄壳山核桃、松子、开心果和腰果中生育酚的比较研究结果显示，薄壳山核桃种仁的γ-生育酚含量也排名第二[24]。Miraliakbari和Shahidi[6]比较了杏仁、巴西胡桃、榛子、松子、开心果、核桃和薄壳山核桃氯仿提取物中γ-生育酚的含量，结果显示薄壳山核桃中含量最高。尽管结果略有不同，但能看出薄壳山核桃种仁的生育酚含量高，显示其在人类健康领域的广阔应用前景。

尽管薄壳山核桃种仁生育酚含量较高，但生育酚在不同薄壳山核桃品种及单株中含量变异较大，影响生育酚含量的因素也较多。Villarreal-Lozoya等[17]对6个美国产薄壳山核桃品种（‘Kanza’‘Nacono’‘Kiowa’‘Pawnee’‘Shawnee’和‘Desirable’）的成熟种仁生育酚含量进行测定，γ-生育酚的含量为72～135 μg·g-1，变异系数（CV）为21.21%，其中‘波尼’的γ-生育酚含量为100 mg·kg-1，与本实验结果（95.85 mg·kg-1）接近。Chun等[25]对美国产3个品种（‘Desirable’‘Stuart’和‘Schley’）成熟种仁的研究表明，γ-生育酚含量为20.1～29.3mg·100g-1，α-生育酚含量为0.9～1.4 mg·100 g-1，δ-生育酚含量为0.1～0.4 mg·100 g-1，且品种间差异显著（p ＜0.05）。Robbins 等[18]测定了美国产的11 个品种的生育酚含量，γ-生育酚含量为15.37～27.73 mg·100 g-1，其中‘波尼’‘斯图尔特’和‘威奇塔’的γ-生育酚含量分别为20.44、21.22～25.16 和22.53～25.83 mg·100 g-1。Toro-Vazquez 等[16]对墨西哥三个主产区的薄壳山核桃种仁（品种未明确） 进行研究，α-,γ-,δ-生育酚 分别为83.21～89.98 mg·kg-1、109.59～182.81 mg·kg-1和31.40～78.77 mg·kg-1。Rudolph等[20]对美国产的70 个薄壳山核桃品种发育中期种仁的研究结果显示，发育中期生育酚的含量为131～493 μg·g-1，该实验为薄层板分离，硅烷化后气相测定，其中‘Stuart’成熟种仁为40 μg·g-1。于敏等[26]测定了浙江种植的29个薄壳山核桃优良单株中的α-生育酚的含量，结果为0.46～2.28 mg·mL-1。我们的实验结果更接近Villarreal-Lozoya等[17]和Toro-Vazquez等[16]的结果。测定方法、遗传背景、环境因子、成熟期等均有可能影响生育酚的含量[16,20]。另外，生育酚的含量也会随薄壳山核桃的贮存而逐渐降低[27,28]。选育高生育酚含量的薄壳山核桃品种具有显著的健康意义，明确生育酚的动态变化规律及调控因素对品质育种及生育酚的利用具有重要意义。已有研究表明，不同薄壳山核桃品种及单株中生育酚含量变异大，生育酚在现有品种及单株中含量的变异为机理研究及品质育种提供了优良的试验材料。

另一方面，生育酚并不是薄壳山核桃油中唯一的抗氧化剂。已有的研究发现，薄壳山核桃油和棕榈油含有的油脂含量及生育酚含量类似[16]，然而薄壳山核桃油比橄榄油更稳定而不易被氧化。说明薄壳山核桃油中还含有其他的抗氧化成分，这也需要今后进一步深入研究。