强直性脊柱炎患者与健康人群肠道细菌群落的结构和多样性的差异

叶国裕 顾海潮

(云南省中医医院/云南中医药大学第一附属医院骨伤科一病区，昆明市 650021，电子邮箱：guoyuye@hotmail.com)

肠道微生物群失调和微生物感染已涉及多种免疫介导的疾病，如强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)和炎症性肠病等[1]。AS是一种有较高致残率的自身免疫性疾病，发病原因并未十分清楚，目前认为其可能与遗传、生活环境、病毒、细菌感染等因素相关[2]。遗传因素在AS的发病中具有重要作用，其中HLA-B27基因与发病明显相关；与AS患病相关的遗传因子可能会在共同的环境因素作用下触发疾病[3]。有研究显示，肠道微生物也参与了AS的发生与发展[4]。有学者通过全基因组扫描研究发现，转化生长因子β1、白细胞介素1、杀伤细胞免疫球蛋白样受体等基因与AS的发生与发展存在一定的相关性，而这些基因对调节肠道免疫有重要作用[5]。还有研究表明，与健康人群相比，AS患者及其一级亲属患者的肠道通透性有一定程度增加[6]。然而，目前临床上尚未涉及AS患者肠道微生物菌群特征的研究。鉴于此，本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析AS患者与健康人群肠道细菌群落的结构和多样性的差异。

1 资料与方法

1.1 临床资料 连续纳入2014年7月至2017年7月期间在云南省中医医院接受肿瘤坏死因子抑制剂治疗的7例AS患者(表1)。纳入标准：诊断符合1973年修订的纽约AS分类标准[7]。排除标准：(1)患者合并其他肠道疾病；(2)曾接受消化系统手术。1号AS患者入组时仍正在使用非甾体消炎药(nonsteroidal antiinflammatory drug,NSAID)；3号和4号AS患者自述既往偶尔使用NSAID，并且因胃肠不适而中断；其他AS患者自述未使用NSAID，但使用对乙酰氨基酚和/或曲马朵。另纳入6例健康对照受试者作为对照。所有研究对象均签署知情同意书；研究获得云南省中医医院伦理研究委员会的批准。所有研究对象的一般资料见表1。

表1 AS患者及健康对照者的一般资料

1.2 粪便收集和粪便干重测定 每例研究对象每月收集1次粪便样本，每次收集粪便量不少于50 g，共收集4次粪便样本。将粪便收集在密闭管中，称重后得到粪便湿重；再将粪便敞开放置于65℃电热恒温干燥箱内干燥24 h，再次称重即为粪便干重。为确保样品均匀性，测定干重后用无菌水(重量和体积比例按照1 g/2 mL计算)将粪便样品稀释，然后在无菌塑料袋中快速捏合约5 min；将每份样品等分为两份，一份用于DNA提取，其余-20℃下保存待用。

1.3 DNA提取和量化 将稀释后的200 mg粪便样品置于离心管中，加入1.4 mL ASL缓冲液(武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：120316)后在95℃下反应5 min，然后根据QIAamp DNA Stool Mini Kit粪便DNA基因组提取试剂盒(德国QIA GEN公司，批号：51504)的说明进行DNA提取。将提取的DNA溶解于50 μL缓释液AE洗脱缓冲液(武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：100523)。通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量，在UV20紫外透照仪(美国Hoefer公司)上显影并照相。

1.4 PCR-DGGE分析 使用PCR-DGGE技术来评估各个粪便标本中的微生物群落分布。(1)PCR扩增：为了提高PCR产物的特异性，本研究使用巢式PCR进行扩增。第一步扩增采用的引物为16s1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，再使用第二套引物PRBA338f：5′-CGC CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增[8-9]。通过PCR扩增细菌16S rRNA基因V3区(5′-ATTA CCG CGG CTG CTGG-3′)[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用GC夹技术(序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGC)夹在正向或反向引物的5′-末端，以防止DNA完全变性为单链，可改善变性凝胶中的带分辨率。最终的PCR反应混合物包含缓冲液5 μL、 25 mmol/L MgCl24 μL、20 mg/mL牛血清白蛋白2.5 μL，每个引物(母液浓度为25 μM)各0.75 μL， 5 U/μL Taq聚合酶1 μL和DNA模板1 μL 。采用两步法进行PCR扩增，第一轮与第二轮的扩增条件均为94℃ 5 min，然后进行30个循环的92℃变性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸30 s；最后在72℃进行15 min延伸。选择Hind Ⅲ Digest DNA Marker(上海超研生物科技有限公司，批号：IP67Q)平行电泳作为分子量标准来证实PCR扩增产物。在紫外透照仪上观察凝胶并照相。(2)灌制变性梯度胶：参照DGGE的最佳适用范围，本实验中使用8%的丙烯酰胺凝胶，并按照标准流程进行灌胶。(3)电泳：DGGE切胶后做PCR扩增[11]。在变性梯度范围为25%～50%、45%～60%、35%～65%的8%聚丙烯酰胺凝胶上分离相等质量的PCR产物。电泳条件为50 V 10 min，然后切换至200 V 5.5 h，温度保持在60℃。(4)染色及拍照：使用SYBR GreenⅠ核酸染色剂2 μL(上海超研生物科技有限公司，批号：201405)对丙烯酰胺凝胶进行凝胶染色，在紫外透照仪上观察并拍照。(5)细菌DGGE带形谱和序列分析：根据条带的存在与否计算DGGE谱中条带模式之间的相似性并以相似系数表示。DGGE胶通过扫描仪输入计算机，用Molecular Analysis软件进行相似性聚类分析，通过序列相似性水平划分得到各样品间可操作分类单元，对每个群落的簇进行分类鉴定；在经DGGE分析后得到的指纹图谱中，每个条带代表某个微生物优势菌群，经测序和序列比对，得出优势菌群的种类，最终获得AS患者和健康对照受试者中粪便微生物群多样性的树状图。应用R语言扩展包vegan软件分析粪便微生物群落主坐标(principal coordinate analysis,PCoA)，导入原始的OTU丰度表格文件，加载vegan包，计算样本间距离，对样本进行PCoA排序分析。

1.5 数据分析 本实验每个时期的处理均进行3个重复，以考虑分析变异性，最终取平均值进行统计。使用SAS(版本9.1)软件分析DNA含量；采用SPSSAU软件进行置换多元方差分析检验粪便微生物群落与AS之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 粪便微生物群的PCR-DGGE分析结果 图1显示了25%～65% DGGE粪便样品的微生物指纹图谱。在聚丙烯酰胺凝胶上分离出的186条DNA带中，大部分在35%～55%变性梯度之内。分别在每例AS患者和健康对照受试者的样品中发现10～16个和13～19个条带的DNA片段。所有条带均被切割和识别，基于超过97%的同一性，仅成功鉴定出37个条带。图1所示的PCR-DGGE图谱的树状图根据未识别和已鉴定的条带的位置而建立，并被分为A和B两个簇，其中簇A由所有健康对照者(HC1至HC6)组成，簇B由所有AS患者(AS1至AS7)组成。

图1 粪便微生物群的PCR-DGGE分析图谱

2.2 经PCR-DGGE测定获得的细菌 共检测到11种菌属。拟杆菌属和普拉梭菌是簇A中检测到的主要细菌，其含有受试者HC1、HC2、HC3、HC4、HC5和HC6，而仅在健康对照受试者HC2中检测到罗斯拜瑞氏菌和普氏菌。普拉梭菌和普氏菌是簇B中检测到的主要细菌，在所有AS患者中均检测到，但仅在AS1中检测到罗斯拜瑞氏菌和AS5中检测到大肠梭菌。见表2。

表2 PCR-DGGE测定获得细菌

2.3 粪便微生物群落与AS之间的关系 在R语言扩展包vegan软件中利用箱形图可视化两组微生物群的Alpha多样性指数，Alpha多样性盒图(图2)显示，AS样品中微生物多样性(即观察到的物种)为(664±132)个种类，而健康对照者为(483±246)个种类；置换多元方差分析结果显示，AS患者与健康对照者之间的粪便微生物群落多样性差异具有统计学意义(P<0.001)。

图2 健康对照者与AS患者的粪便微生物构成数量

粪便微生物群落 PCoA分析显示，在分析图中AS样本的分布较分散，样品间距离较远，粪便微生物群落结构差异较大；而健康对照者样本分布较聚集，粪便微生物群落结构相似性高，见图3；UniFrac距离分析显示，生物学重复和技术重复之间的差异小于个体和疾病状态之间的差异(P<0.001)，表明疾病是影响粪便微生物群落差异的主要因素，见图4。

图3 健康对照者与AS患者粪便微生物群落PCoA的二维排序

图4 UniFrac距离分析(*P<0.001)

3 讨 论

越来越多的证据表明，肠道菌群失调在一些脊椎病的发病中扮演着重要角色，包括脊柱关节炎和AS。最新研究显示，与健康对照组相比，AS患者的回肠末端有离散的微生物特征[12]。本研究利用16S rRNA图谱对AS患者肠道菌群的表征进行了分析和鉴定，结果显示，AS患者和健康受试者的肠道菌群多样性存在明显差异(P<0.05)；PCoA分析提示与健康受试者相比，AS患者粪便中存在离散的微生物特征，这证实了上述报道结果，表明不同疾病患者的菌群分布差异并不是因为总体菌群数量差异引起的，而是与肠道菌群的多样性有关。而PCoA分析仅能显示AS患者与健康对照者的粪便微生物群落结构差异，后期将需要更大规模的研究来确定涉及的单个细菌种类。此外，平均UniFrac距离显示，生物学重复和技术重复之间的差异小于个体和疾病状态之间的差异(P<0.05)，进一步证实疾病状态与微生物群落组成之间的关系，表明微生物群落组成的差异不是由于标本中的异质性或缺乏技术可重复性导致的，而主要是由疾病导致的。 研究表明，随着群落多样性的增加，微生物的总体数量没有变化，这表明某种特定微生物的过度生长或优势地位并不能驱动特征改变[13]。然而，有小鼠实验表明，肠道菌群的整体组成以及特定微生物的存在和/或缺失都可能对宿主的反应、炎症的调节和肠道细胞的发育产生重大影响[14]。有学者在K/BxN小鼠关节炎模型中发现，将寄生于肠道的分枝丝状细菌引入无细菌的小鼠中，就足以恢复Th17细胞至正常表达水平，导致自身抗体和关节炎的产生；而当白细胞介素17加入特定的无致病K/BxN小鼠中进行中和时，可防止关节炎的发生[15]。因此，单个共生微生物通过其促进特定T辅助细胞亚群的能力，可以驱动免疫介导的疾病。

本研究发现不同AS患者的粪便样品微生物群落组成存在很大差异。目前已发现毛螺菌属、瘤胃菌科和普氏菌与结肠炎和克罗恩氏病有很强的相关性，特别是普氏菌可在胃肠道中引发强烈的炎症反应[16]。本研究中，普氏菌是在AS患者中检测到的主要细菌，且在所有AS患者均检测到。普氏菌(DSM 18305)的基因组分析表明，该物种含有炎症基因，这些基因可能分别编码炎症因子释放所必需的调控激素[17]，而这可能解释了为什么大多数普氏菌是在AS患者中发现的。

目前认为HLA-B27与AS强烈关联，已有学者在HLA-B27转基因的脊柱关节炎大鼠模型中观察到肠道微生物组中普雷沃氏菌科增加和理研菌科减少，表明潜在的宿主遗传学功能可能在改变肠道微生物群中发挥作用[18]；并推测HLA-B27通过影响肠道微生物群而诱导AS，反过来驱动诱发脊椎关节炎的免疫过程(如IL-23的产生)[19-20]。因此，将来我们还需要进一步研究肠道微生物组成的变化是否与宿主遗传学有关，区分宿主基因组和免疫系统与肠道菌群之间的因果关系，以及宿主遗传学如何影响患者的肠道微生物群落的整体功能，包括微生物群落如何形成免疫应答并影响炎症，以更好地解释AS的发病机制。

总之，AS患者和健康人群肠道细菌群落的结构和多样性存在差异，健康人群往往具有较高的拟杆菌属丰度，而AS患者具有较高的普氏菌丰度；肠道微生物组成可能与AS有关。这或可为AS的诊疗提供有用的数据。