酶法制备含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的国际研究进展

Dilay Sen，Derya Kahveci

（土耳其伊斯坦布尔科技大学 化学与冶金工程学院 食品工程系，土耳其 伊斯坦布尔 34469）

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是一类重要的营养物质。根据靠近脂肪酸分子甲基端的第一个双键的位置，多不饱和脂肪酸主要分为ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3多不饱和脂肪酸主要是α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA，C18:3），ω-6多不饱和脂肪酸主要是亚油酸（linolenic acid，LA，C18:2）。这两种脂肪酸（FAs）都不能在体内合成，因而是必需的营养物质，被称为必需脂肪酸。ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸在代谢过程中使用相同的酶，因此，ALA和LA的相对含量会影响彼此的代谢效率[1]。

目前研究表明，ω-3多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20:5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22:6）对人体健康有益。在成人体内只有不到8%的ALA转化为EPA，而ALA向DHA的转化则可忽略不计（＜0.02%～4%）。因此，EPA和DHA都应通过饮食摄入进行补充。ω-3多不饱和脂肪酸的主要来源是海产品，由浮游植物和藻类合成，经食物链进入鱼类和海洋哺乳动物的脂质中[2]。为了充分发挥ω-3多不饱和脂肪酸对人体健康的益处，建议将此类必需脂肪酸引入食品和油脂中，而非食用鱼类。Ward和Singh[3]指出，每天摄入1 g EPA和DHA需要食用60～135 g鲑鱼，这引起了人们对富含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的兴趣。

可以通过化学酯交换或酶促酯交换的方法进行油脂改性，其工艺过程如图1所示。由于ω-3多不饱和脂肪酸的高不饱和度，特别易于氧化，因此需要在高温下进行的化学酯交换不适用于此类油脂。此外，ω-3多不饱和脂肪酸在甘油骨架上的位置对其在体内的消化吸收有重要影响。ω-3多不饱和脂肪酸位于甘油骨架的sn-2位上时可有效防止氧化[4]，而且以2-单酰基甘油（2-monoacylglycerol，2-MAG）的形式更利于吸收利用[5]。因此，具有特异选择性的酶法酯交换更适合制备富含ω-3多不饱和脂肪酸的油脂。

本文将简要介绍含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的营养特性，并重点评述2015—2019年酶法制备含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的国际研究进展。

图1 化学酯交换和酶促酯交换反应过程流程图（改编自参考文献6）。

1 ω-3多不饱和脂肪酸的营养功效

20世纪70年代以来，研究发现格陵兰爱斯基摩人的低冠心病发病率与他们对多脂鱼类的高摄入量有关[7]，因此，人们开始关注ω-3多不饱和脂肪酸对健康的影响。ω-3多不饱和脂肪酸主要是通过改变细胞膜脂组成、细胞代谢、信号转导和调控基因表达而发挥作用，它们可以调控肝脏、心脏、脂肪组织和大脑中的基因表达[8]。根据现有的研究，ω-3多不饱和脂肪酸在预防和治疗心血管疾病、高血压、糖尿病、关节炎和其它炎症性及自身免疫性疾病和癌症方面发挥着重要作用，对正常的生长发育，尤其是大脑和视网膜的生长发育至关重要。

1.1 对心血管疾病的功效

心血管疾病是所有影响心脏和循环系统的疾病的通称。它是西方社会人群的主要死亡原因，并且与西方饮食中常见的高脂肪摄入，尤其是饱和脂肪的摄入有关。经常食用含ω-3多不饱和脂肪酸的鱼或鱼油可降低冠心病的发病率和死亡率[9]，这已被流行病学研究充分证实[10]，然而，为了预防心血管疾病而食用的ω-3多不饱和脂肪酸补充剂的作用，至今仍存在争议[11]。研究表明，鱼对心血管疾病风险的有益影响是源于鱼体内营养物质的协同作用，而不仅仅是ω-3多不饱和脂肪酸的作用。

1.2 对癌症的功效

癌症一词涵盖了100多种疾病。ω-3多不饱和脂肪酸已被证实具有抗癌作用，特别是对乳腺癌[12]、结肠癌[13]和前列腺癌[14]。此外，ω-3多不饱和脂肪酸可能会增加肿瘤细胞对常规疗法的敏感性，从而提升常规疗法的功效，特别是对治疗耐药癌症的疗效[15]。

1.3 对糖尿病的功效

胰岛素在细胞水平参与脂肪酸代谢的各个方面，这也与糖尿病相关。大量人群实验的结果表明，ω-3多不饱和脂肪酸对高甘油三酯血症具有积极作用且可改变胆固醇的分布，因此，建议对糖尿病患者使用ω-3多不饱和脂肪酸[16]。其中一个有趣的发现是，爱斯基摩人胰岛素抵抗和葡萄糖不耐症的发病率迅速增加，这与从食用含高ω-3多不饱和脂肪酸和低饱和脂肪酸（saturated FAs，SFA）的天然鱼类和海洋哺乳动物转变为食用低ω-3多不饱和脂肪酸和高饱和脂肪酸的食品有关[17]。

1.4 对炎症性疾病的功效

炎症是一系列急性和慢性人类疾病的组成部分，其特征是炎症性细胞因子的产生。花生四烯酸（arachidonic acid，AA，C20:4）的衍生物类花生酸具有促炎效应。另一方面，ω-3多不饱和脂肪酸代谢产生了消炎介质[18-19]，称为消退素、保护素和巨噬细胞消炎素。它们既有直接作用（例如，通过代替AA作为类花生酸底物并抑制AA代谢），又有间接作用（例如，通过影响转录因子激活改变炎症基因的表达）[18，20-21]。此外，食用富油鱼类也可有效预防儿童哮喘[22]。

1.5 对神经组织发育的功效

ω-3多不饱和脂肪酸，尤其是DHA，是人脑的重要组成部分，脑内约三分之一的脂质由ω-3多不饱和脂肪酸组成。大脑发育中DHA的减少与动物体内神经元再生的减少、神经递质代谢的不足、学习和视觉功能以及运动技能的改变有关[23]。此外，流行病学研究表明，孕妇DHA水平低与其婴儿神经和视觉系统发育不良风险增加之间存在关联[24-26]。孕妇饮食中包含EPA和DHA对于确保她们的脂肪组织中含有这些必需脂肪酸，以供发育中的胎儿和母乳喂养的新生儿成长发育是非常重要的[27]。ω-3多不饱和脂肪酸对神经系统的另一个作用是预防精神疾病。尽管这些疾病的病因还不完全清楚，但目前的研究表明，食用ω-3多不饱和脂肪酸可降低抑郁的风险[25，28-29]，并改善慢性患者的抑郁症状[30]。患有单相抑郁症、季节性冬季情感障碍或社交焦虑障碍患者，红细胞膜和血浆中的EPA浓度[31]和DHA浓度[31-32]含量较低[25]。

1.6 对其他疾病的功效

其他报道的ω-3多不饱和脂肪酸的作用包括增强体重减轻对超重患者血脂血糖和胰岛素水平的影响[33-34]、降低血压[35]、减轻类风湿关节炎、神经肌肉痛、炎症性肠病、痛经[36-37]、减少更年期妇女的潮热[38]等。

轻度消化不良和打嗝是食用鱼油的主要不良反应。汞和多氯联苯等环境毒素可能污染鱼类等海洋产品，并对人类造成潜在危害[39]。

2 含有ω-3多不饱和脂肪酸的结构脂质

结构脂质（structured lipids，SLs）是具有特殊功能或营养特性的重组甘油三酯（triacylglycerols，TAGs）。结构脂质的制备是通过化学或酶法改变甘油三酯的脂肪酸组成或脂肪酸位置分布。

sn-1和sn-3位置含有中碳链脂肪酸（M）和sn-2位置含有ω-3多不饱和脂肪酸（L）的结构脂质因其营养特性而备受关注。这种脂质被称为MLM型结构脂质，综合了不同链长脂肪酸的营养功能，并在体内消化代谢过程中发挥健康效应。摄入后，甘油三酯通过舌、胃，更主要是通过胰脂肪酶水解为2-单酰基甘油（2-MAG）和2个脂肪酸。对于MLM型结构脂质，消化产物是富含ω-3多不饱和脂肪酸的2-MAG和中碳链游离脂肪酸（medium-chain free fatty acids，MCFFA），后者具有更高的血浆清除率、更高的氧化速率、更好的氮平衡作用和更少沉积在脂肪组织中的倾向。因此，MLM型结构脂质适合为吸收不良患者、短肠综合征患者、烧伤后的恢复患者以及早产儿快速提供能量。但是，富含中碳链脂肪酸的油脂往往缺乏必需的ω-3多不饱和脂肪酸。将ω-3多不饱和脂肪酸结合到甘油骨架的sn-2位置，可以更好地防止氧化[4]以及更好地以2-MAG形式被吸收[5]。MLM型结构脂质对免疫功能、氮平衡和血液中的脂质清除具有积极作用，不仅可以作为消化不良和脂质吸收不良患者的营养物质来源，而且还可以作为老年人的高附加值保健品[40]。

酶法合成结构脂质主要有三种方法：（1）富含ω-3多不饱和脂肪酸的甘油三酯与中碳链脂肪酸的酸解反应，其目的是用中碳链脂肪酸取代sn-1，3位置的脂肪酸、保留sn-2位置的ω-3多不饱和脂肪酸，反应结束后，游离脂肪酸可经蒸馏或碱提后除去。（2）分别富含ω-3多不饱和脂肪酸和中碳链脂肪酸的两个甘油三酯进行酯交换反应。如果可以抑制水解反应，则产物将只有重组甘油三酯，通过去除催化剂即可回收产物。然而，产生的重组甘油三酯将包括MLM型结构脂以及其它重组甘油三酯。因此，此方法不适合制备纯MLM型结构脂质。（3）两步法，首先是甘油三酯醇解反应生成富含ω-3多不饱和脂肪酸的2-MAG，再与中碳链游离脂肪酸发生酯化反应制得。醇解反应后分离除去副产物，因此，该方法是合成高纯度结构脂质的最适宜路线。sn-1，3特异性脂肪酶，尤其是来源于Rhizomucormiehei和Thermomyceslanuginosus的固定化脂肪酶，应用广泛。表1总结2015—2019年该主题的研究进展，更早的研究已经在其它文献中进行了综述[48-49]。

表1 2015—2019年酶法制备含ω-3多不饱和脂肪酸结构脂质的国际文献汇总

产物的产量和纯度取决于所用脂肪酶的特异选择性。例如，来源于Candida rugosa的脂肪酶由于具有脂肪酸特异性而不适合催化富含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的酸解反应制备结构脂质[50-51]。研究表明，Candida rugosa脂肪酶不仅能特异识别甘油三酯的脂肪酸，而且可以识别整个甘油三酯分子[52-53]。Candida rugosa脂肪酶催化的水解反应分为两步：不含DHA的甘油三酯分子首先被水解，随着反应的进行，含有DHA的甘油三酯分子也被水解。由于甘油三酯的酸解反应是连续的水解与酯化反应，因此，Candida rugosa脂肪酶催化的富含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的酸解反应产率较低。此外，脂肪酶的位置特异性对结构脂质的产量和纯度也有影响。与不具有位置特异性的Candida antarctica脂肪酶B和Psueodomonassp.脂肪酶相比，sn-1，3位置特异性Rhizomucormiehei脂肪酶在催化月桂酸和海豹油酸解制备MLM型结构脂质中最为有效[54]。

含ω-3多不饱和脂肪酸的结构脂质的氧化稳定性是一个有待解决的主要问题[55]。近年来，富含多不饱和脂肪酸油脂体系中乳液模板化油凝胶的氧化稳定性引起了科研人员的关注。为了提高富含ω-3多不饱和脂肪酸结构脂质的氧化稳定性，进行了油凝胶微胶囊的研究。以β-谷甾醇/γ-谷维素的植物甾醇混合物或蔗糖硬脂酸酯/抗坏血酸棕榈酸酯的混合物作为油凝胶剂，以鲱鱼鱼油或鲱鱼鱼油与辛酸和/或硬脂酸制得的结构脂质作为脂质相制备了油凝胶。结果显示，油凝胶及其微胶囊改善了脂质的氧化稳定性[56]。之前的一项研究发现了相似的结果，即内部结构（油凝胶）和外部涂层（微胶囊）都提高了油脂氧化稳定性，原因是它们都对油脂进行了氧暴露的防护，而氧暴露是导致脂质氧化的主要因素[57]。研究表明，与液态油相比，由茶多酚棕榈酸酯颗粒和柑橘果胶构成的茶油（富含油酸）凝胶具有更高的氧化稳定性，这可能是茶多酚棕榈酸酯及其形成的凝胶都具有抗氧化功能的结果[58]。

3 酯交换法制备富含ω-3多不饱和脂肪酸的脂质

将ω-3多不饱和脂肪酸引入到长碳链脂肪酸油脂中，可以改善其营养特性。此类脂质的典型案例就是母乳脂替代品（human milk fat substitutes，HMFS）。母乳脂成分独特，其sn-2位置主要是棕榈酸（约占sn-2脂肪酸总量的60%）。研究表明，在母乳脂中，sn-2位置大量的棕榈酸能提高婴儿对脂肪和钙的吸收，并防止钙皂的形成。婴儿期和幼儿期的大脑发育需要饮食中含有充足和均衡的ω-3多不饱和脂肪酸，其中，DHA对婴儿神经系统的早期发育尤为重要。多项研究表明，血液DHA水平与认知和视觉功能的提升呈正相关，这种影响一直持续到幼儿时期[59]。婴儿出生后，母乳是婴儿ω-3多不饱和脂肪酸的唯一来源，其含量取决于母亲的饮食。如果母亲患有ω-3多不饱和脂肪酸缺乏症和/或无法进行母乳喂养，则应通过配方奶粉补充ω-3多不饱和脂肪酸。制备母乳脂替代品最常用的方法是用三棕榈酸甘油酯或sn-2位富含棕榈酸的结构脂质与各种来源的游离脂肪酸进行酸解反应。除纯油酸外，还使用了从不同植物油（如橄榄油、榛子油、葵花籽油、大豆油、红花油、菜籽油、鱼油或微生物油脂）中获得的可以作为ω-3多不饱和脂肪酸（主要是DHA和AA）来源的其它游离脂肪酸[60-61]。当前的研究热点聚焦于DHA和ARA在母乳脂替代品甘油三酯特定位点的引入，因此，筛选能够催化制备具有特定功能结构脂质的脂肪酶的研究大幅增加[62-63]。

除了母乳脂替代品外，其他食用油也经过酶催化，引入ω-3多不饱和脂肪酸以提高其营养价值。2001—2009年期间的研究主要有三油酸甘油酯[64-65]、榛子油[66]、橄榄油[67]、大豆油[68]和棕榈油[69-70]与ω-3多不饱和脂肪酸的酸解反应，鲱鱼鱼油与松脂酸[71]、鸡肉脂肪游离脂肪酸[72]和共轭亚油酸[73]的酸解反应，富含DHA的2-MAG与油酸的酯化反应[74]，棕榈仁油[75]与棕榈油硬脂、硬脂酸乙酯（EE是乙酯的缩写，硬脂酸乙酯缩写应该是SAEE）[76]与富含ω-3多不饱和脂肪酸甘油三酯的酯交换反应。

4 酶法制备ω-3多不饱和脂肪酸浓缩液

浓缩液可提供更高浓度的ω-3多不饱和脂肪酸，同时减少饱和与单不饱和脂肪酸、以及总脂肪的摄入量。此外，鱼类消费负面影响的主要关注点[77]为汞含量，商品鱼油胶囊的汞含量从未检出，可以忽略不记[78]。

ω-3多不饱和脂肪酸的主要浓缩方法有色谱分离、分馏或分子蒸馏、低温结晶、超临界流体萃取和尿素络合法等。酶法与上述方法相比有许多优点。酶法不涉及极端pH值和温度，从而避免因氧化、顺反异构化或双键迁移而部分破坏ω-3多不饱和脂肪酸的天然全顺式结构。同时，温和的反应条件也降低了工艺成本。酶法的特征之一是，由于脂肪酶的底物和位置特异性，其产物也是定向可控的。

脂肪酶催化水解、醇解和酯化反应均可用于制备ω-3多不饱和脂肪酸浓缩液。2015—2019年脂肪酶催化水解制备ω-3多不饱和脂肪酸浓缩液的国际研究情况见表2。水解反应的底物是脂质和水，方法简单且环境友好。水解反应的产物可以简单地通过沉降或离心进行分离。反应通常在搅拌反应釜中进行，由于是间歇工艺，无法实现在线去除副产物（游离脂肪酸），而游离脂肪酸的积累会促使水解反应速率逐渐降低。可以通过皂化或蒸馏的方式从产物中脱除游离脂肪酸。

表2 2015-2019年脂肪酶催化水解制备ω-3多不饱和脂肪酸浓缩液的国际文献汇总

在富含ω-3多不饱和脂肪酸油脂的醇解反应中，乙醇是首选。与水解反应相比，在不含水的无溶剂环境中进行的浓缩ω-3多不饱和脂肪酸的醇解反应大大减小了设备体积，并且可以应用于填充床反应器等连续工艺。此外，与水解反应相比，基质混合得更加均匀，并且通过蒸馏更容易从油相中分离脂肪酸乙酯。近几年的研究表明，乙醇解工艺已应用于生产富含ω-3多不饱和脂肪酸的偏甘油酯[87-88]和乙酯[89-90]。富含ω-3多不饱和脂肪酸的乙酯可作为药物制剂使用。从营养角度来看，偏甘油酯比乙酯更适合作为乙醇解反应的最终产物，因为偏甘油酯具有更好的生物利用率[91]。此外，偏甘油酯作为“天然”产品被推广。

在醇解反应中，可用甘油代替乙醇，以生产富含ω-3多不饱和脂肪酸的偏甘油酯。甘油解反应可以产生不同的甘油酯，且没有脂肪酸损失，之后可以从反应混合物中提取目标脂质。近5年的研究表明，作为有前景的食品组分，具有高ω-3多不饱和脂肪酸含量的甘油二酯（Diacylglycerols，DAG）[92-93]和甘油一酯（monoacylglycerols，MAG）[93-95]可以由脂肪酶催化甘油解反应来制备。甘油酯混合物也可以通过相同的酶法制备[96]，脂肪酸形式的ω-3多不饱和脂肪酸与甘油直接酯化可用于制备富含ω-3多不饱和脂肪酸的甘油酯[97-98]。Halldorsson[99]等通过甘油选择性酯化将EPA和DHA分离，因为EPA与甘油反应的同时DHA仍处于游离脂肪酸混合物中。

5 ω-3多不饱和脂肪酸磷脂

富含ω-3多不饱和脂肪酸磷脂（phospholipids，PL）的制备受到了关注，因为此类磷脂拥有除了多不饱和脂肪酸本身功能以外的新功能[100]。位于磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）sn-2位置的DHA具有更强的细胞通透性、抗肿瘤活性和细胞毒性。另一方面，含有EPA的磷脂可以降低大鼠脂肪组织的重量。催化制备磷脂的酶主要有脂肪酶和磷脂酶。磷脂sn-1位脂肪酸的改性可由磷脂的酸解或酯交换反应实现。磷脂酶A1（Phospholipase A1，PLA1）催化卵磷脂与EPA、DPA和DHA混合物的酸解反应生成富含多不饱和脂肪酸的卵磷脂，其中35%的脂肪酸为多不饱和脂肪酸[101]。加水可以降低多不饱和脂肪酸的引入量，尽管结果尚未正式报道，但体系中的水预计会降低产物得率。即使不加水，水解反应也不可避免，产物中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）的含量为13.7%。不同作者的相似研究得到了同样的结果[102]。当反应时间超过6 h时，酸解使多不饱和脂肪酸在磷脂酰胆碱中的含量增加，在24 h内从21%增加到28%，但水解程度的增加导致了磷脂酰胆碱产率显著降低。考虑到磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱水平以及多不饱和脂肪酸的引入，确定了固定化磷脂酶A1催化磷脂酰胆碱酸解反应的最佳水活度为0.65[103]。除了磷脂酶A1，脂肪酶也可以用于制备富含多不饱和脂肪酸的磷脂。EPA和DHA与溶血磷脂可在脂肪酶的催化下发生区域选择性酯化反应制备磷脂酰胆碱，产率达30%以上[104]。固定化Candida antarctica脂肪酶B是引入DHA的唯一有效酶，而EPA则可以通过固定化Candida antarctica脂肪酶B或者固定化Rhizopusarrhizus脂肪酶引入。Peng[105]等比较了脂肪酶催化酸解反应将不同脂肪酸引入大豆磷脂的结合率。共轭亚油酸和辛酸的结合率相似，但EPA和DHA的结合率相对较低。

2016年，Li等[106]通过固定化磷脂酶A1在无溶剂体系中催化磷脂酰胆碱与富含DHA/EPA的乙酯进行酯交换反应，成功合成了富含DHA/EPA的磷脂酰胆碱。在温度55.7 ℃，加水量1.1wt%，底物质量比（乙酯/磷脂酰胆碱）6.8∶1的条件下，最大结合率为19.09%（24 h）。当加水量大于0.5wt%时，固定化磷脂酶A1的活性更高。24 h的真空处理显著增加了DHA/EPA的结合率和富含DHA/EPA磷脂酰胆碱的含量，72 h DHA/EPA的结合率最高（30.31%），富含DHA/EPA磷脂酰胆碱的产率为47.2%[106]。2019年，Wang等[107]研究表明，固定化来源于海洋Streptomyces sp.菌株W007的脂肪酶（MAS1）可在无溶剂体系中催化富含ω-3多不饱和脂肪酸的乙酯与磷脂酰胆碱进行酯交换反应。优化实验条件下，24 h内，ω-3多不饱和脂肪酸最大结合率为33.5%，表面固定化MAS1脂肪酶是一种具有较高催化活性的磷脂改性生物催化剂[107]。磷脂酶A2（PLA2）专一催化多不饱和脂肪酸酯化至磷脂的sn-2位。磷脂酶A2催化磷脂酰胆碱与EPA乙酯在多种有机溶剂中进行酯交换反应[108]，甲苯中EPA的结合率最高，水通过可逆水解反应形成溶血磷脂酰胆碱而影响反应的产率，含EPA磷脂酰胆碱的最高产率为14.3%。

6 结语

ω-3多不饱和脂肪酸对人体的营养价值及其对加工条件的敏感性，引起了人们对温和加工技术如酶催化工艺的高度关注。对于鱼油或任何其它油脂中ω-3多不饱和脂肪酸的富集，无论水解、酸解、醇解、酯交换还是酯化反应，所有酶促反应均可在室温、常压和氮气保护下进行。因此，与传统方法相比，脂肪酶催化鱼油制备长碳链ω-3多不饱和脂肪酸的将更安全、高效。