降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇直投菌剂发酵制备工艺研究及初步应用

杜 稳，常晓娇，赵一凡，管玉龙，孙长坡，刘虎军

（1.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京，100037；2.安徽古井贡股份有限公司，安徽省 亳州，236800）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生的一种剧毒次级代谢产物。谷类作物在生长、收割、仓储，加工、运输、销售等诸多环节均可能发生霉变，从而产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇[1-2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇一方面使饲料行业蒙受巨大损失，另一方面，可导致畜禽食欲废绝、发育受阻、代谢紊乱、免疫失调，造成母畜不孕、孕畜流产，胎儿异常等繁殖性能障碍，对畜牧业造成严重破坏[3-5]。目前，DON的脱除方法有吸附法、紫外法、生物降解法等，而生物降解法可通过微生物释放胞外酶作用于DON，使其转化为低毒或无毒的代谢产物，具有彻底，无二次污染的特点。程亮等[6]通过筛选得到可以降解DON的假单孢菌，徐剑宏等[7]通过筛选得到可以降解DON的德沃斯氏菌，李晓凤等[8]通过筛选得到降解DON的肠杆菌，谭剑等[9]通过筛选鉴定得到一株枯草芽孢杆菌可有效降解DON。由此可见，生物降解法因其具有高效针对性，环境友好性等特点，正广泛受到关注。

枯草芽孢杆菌是在自然界中广泛存在的一种好氧性产芽孢杆菌[10］，它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，是很好的生物防控菌。芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等多种抗逆性，在工业发酵生产的过程中，需要提高芽孢的生成率，以保证后期产品的活性，郭夏丽，王法富等[11-12]通过摇瓶对产芽孢的培养基和发酵参数进行了初步优化，确定培养基配方和摇瓶发酵参数，但缺乏系统的发酵罐制备工艺研究。芽孢一般被加工成菌剂并且应用于多种领域，曹丁等[13]用产抗菌肽芽孢杆菌的菌剂作为饲料添加剂应用于仔猪生产，减少仔猪腹泻，提高断奶仔猪的成活率；刘年浪等[14]用枯草芽孢杆菌菌剂应用于黄瓜枯萎病防治，使黄瓜显著增产；肖伟等[15]将枯草芽孢杆菌菌剂应用于小麦种子贮藏，在一定程度上抑制了真菌病害对小麦的污染。目前，对芽孢杆菌直投发酵剂制备工艺进行研究并应用于粮食副产物的真菌毒素生物降解，鲜有报道。

在前期的工作中，我们筛选鉴定得到一株可以高效降解DON的枯草芽孢杆菌ASAG-35，并对其进行了摇瓶发酵产芽孢条件优化，通过单因素及正交实验等确定了该降解菌的最佳发酵培养基。在该工作的基础上，本文在发酵罐中对该DON降解菌ASAG-35产芽孢发酵制备工艺进行研究，从而提高枯草芽孢杆菌的芽孢总量和芽孢率，并将该菌制作成直投发酵菌剂，初步应用于污染粮食中DON毒素的降解，为开展该菌剂的工业化生产和应用提供了数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验菌种与培养基

降解DON枯草芽孢杆菌ASAG-35由本实验室提供。

活化培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂2 g/L。

种子培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

发酵培养基：小麦麸皮5 g/L，玉米粉3 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，硫酸锰0.2 g/L，发酵培养基配方通过优化获得[16]。

补料培养基：糖蜜2～20 g/L。

菌落计数培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂2 g/L。

单物料培养基：玉米、小麦加工副产物物料150 g，物料通过外加DON毒素，将DON含量设置为（3 000±50）μg/kg，加水定容到1 L，调节pH到6.5，121 ℃灭菌20 min。玉米或小麦副产物液态物料直接使用，调节pH到6.5，121 ℃灭菌20 min。

复合物料培养基：复合物料（玉米皮∶蛋白粉∶玉米胚∶玉米稀浆=2∶5∶3∶1）150 g，物料通过外加DON毒素，将DON含量设置为（3 000±50）μg/kg，加水定容到1 L，调节pH到6.5，121 ℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器与设备

BLBIO-5GJG-4-H型发酵罐：上海百仑生物科技有限公司；SW-CJ-2F型无菌工作台：苏州安泰空气技术有限公司；PYL-125型培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；EVOLUTION-300型紫外-可见分光光度计：美国THERMO FISHER SCIENTIFIC；Waters e2695高效液相色谱：美国WATERS；YC-015小型喷雾干燥机：上海雅程仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化与种子液的制备

将保藏于-80 ℃冰箱的枯草芽孢杆菌菌种取出，室温解冻后在活化培养平皿上进行三区划线复苏，37 ℃培养16 h。将复苏的枯草芽孢杆菌单菌落转划到新的活化培养基平皿上，37 ℃培养12 h后挑取单菌落接到种子培养基中，37 ℃，220 r/min培养16 h，获得种子液。

1.3.2 5 L自动发酵罐培养

5 L发酵罐按照70%的体积比装液，调节pH到7.0，将培养好的种子液以10%(v/v)的量接入5 L发酵罐，初始发酵条件为温度37 ℃，风量0.2 vvm，转速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，培养26 h。

1.3.3 影响产菌株生长及产芽孢的实验设计

在初始发酵条件基础上，设置不同的发酵温度30、33、35、37、39 ℃，研究温度对菌株生长及产芽孢的影响；设置不同的发酵pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，研究pH值对菌株生长及产芽孢的影响；将葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、果糖、麦芽糖等作为补料碳源，研究其对菌株生长及产芽孢的影响；设置不同补料碳源浓度，研究其对菌株生长及产芽孢的影响；选择最佳发酵温度、pH以及补料碳源浓度，确定最适发酵时间。

1.3.4 发酵菌液浓度的测定

取发酵液，充分混匀后静置10 min，取上层无颗粒杂质的发酵液1 000 r/min离心20 s后取上层发酵液，在分光光度计波长600 nm下测定发酵液的吸光度。

1.3.5 直投菌剂制作方法

将发酵液pH调节为3.5，向其中加入20%（w/v）膨润土后充分搅拌，喷雾干燥机进风温度160 ℃，出风温度70 ℃，风速30 m3/h，以进料量10 mL/min进行喷雾干燥。

1.3.6 活菌数和芽孢数测定方法

活菌数计数方法参照周德庆[17]的《微生物实验手册》中的方法。芽孢总数计数方法[18]：芽孢平板计数是在80 ℃水浴加热20 min后用平板菌落计数法检测芽孢的形成量，芽孢率计算公式如下： 芽孢率% =芽孢数/ 活菌数 ×100%。

1.3.7 DON测定方法

DON含量测定方法参照国标法GB5009.111—2016[19]，高效液相色谱条件如下，色谱柱：C18（259 mm×4.6 mm，5 μm，xbridge）；流动相：水/甲醇=80/20（v/v）；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；进样量50 μL；检测波长：218 nm。DON降解率（%）=降解后培养基中DON含量/原培养基中DON含量×100%。

1.3.8 数据分析

实验重复3次，采用SPSS21.0软件对实验数据进行统计学分析，两组数据的比较采用独立样品T检验进行分析，显著性水平设定为0.05；3组数据间的比较采用单因素方差分析的Duncan’s法进行两两比较分析，显著性水平分析同样设定0.05。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对菌体生长和产芽孢的影响

不同温度对枯草芽孢杆菌生长有着不同的影响，5 L发酵罐接种10%，调节风量0.2 vvm，转速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，温度分别设定30、33、35、37、39 ℃进行发酵，枯草芽孢杆菌发酵生长曲线见图1，发酵结束后活菌数和芽孢数见图2。

图1 不同温度对菌体生长的影响

图2 不同温度对菌体产芽孢的影响

由图1可见，当发酵温度低于37 ℃时，菌体浓度处于较低水平，当发酵温度为37 ℃和39 ℃时，菌体生长状况较好。值得关注的是在发酵对数期，温度37 ℃时的菌体浓度高于39 ℃的菌体浓度，而在发酵进入稳定期后，温度39 ℃的菌体浓度高于发酵温度37 ℃的菌体浓度。由图2可见，随着温度的增加，发酵液中的活菌数和芽孢数以及芽孢率均呈增长趋势，39 ℃的芽孢率为93.6%，显著高于37 ℃芽孢率（P＜0.05）。由此可见，37 ℃更有利于发酵对数期菌体的生长，39 ℃更有利于发酵平稳期芽孢的形成。

2.2 发酵pH对菌体生长和产芽孢的影响

不同pH对枯草芽孢杆菌生长有不同影响，5 L发酵罐接种10%，调节风量0.2 vvm，转速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，温度37 ℃，pH分别设置为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0进行发酵，枯草芽孢杆菌发酵生长曲线见图3，发酵结束后活菌数和芽孢数见图4。

由图3可见，当pH为6.0和8.0，枯草芽孢杆菌的浓度均处于较低水平，pH为7.0时，枯草芽孢杆菌的生长状况最好，菌体浓度OD600可以达到3.5。由图4可见，pH为7.5时，菌体数量虽然低于pH 7.0的菌体数量，但是芽孢数量和芽孢率均高于pH 7.0的芽孢率。由此可见，pH 7.0虽然有利于枯草芽孢杆菌的生长，但是不利于芽孢的生成，而将pH设置为7.5，可以很好的将菌体转化为芽孢，提高芽孢生成率。

图3 不同pH对菌体生长的影响

图4 不同pH对菌体产芽孢的影响

2.3 补料碳源对菌体生长和产芽孢的影响

以发酵培养基作为对照，以添加2%不同碳源的发酵培养基作为实验组，进行枯草芽孢杆菌摇瓶发酵。以5%的接种量接到250 mL摇瓶中（装液50 mL），在转速220 r/min、温度37 ℃、pH自然条件下培养24 h后检测菌体生长和产芽孢能力，结果见图5。

图5 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响

由图5可见，发酵结束后对照组活菌数为3×109CFU/mL，当添加葡萄糖、果糖、淀粉和糊精作为碳源时，枯草芽孢杆菌的活菌数无显著变化（P＞0.05）或有所降低，说明该枯草芽孢杆菌不能有效利用这些碳源，而添加蔗糖、糖蜜和麦芽糖作为碳源，均可以显著提高（P＜0.05）枯草芽孢杆菌的活菌数，而糖蜜效果显著性最强，总活菌数和芽孢数分别为8.1×109CFU/mL和7.8×109CFU/mL，芽孢率为96.3%，所以应将糖蜜作为补料碳源，以提高枯草芽孢杆菌发酵的总活菌数和芽孢产率。

将枯草芽孢杆菌以10%的接种量接到5 L发酵罐中，风量0.2 vvm，转速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，温度37 ℃，pH 7.0，发酵培养12 h后采用一次性补料，分别添加2、5、10、15 g/L的糖蜜，在发酵36 h后检测总活菌数和芽孢数，结果见图6。

图6 不同糖蜜添加量对菌体产芽孢的影响

由图6可见，随着糖蜜添加量的增加，活菌数和芽孢数也逐渐增加，当一次性补加10 g/L糖蜜时，发酵结束后活菌数和芽孢数均为最高，分别为2.0×1010CFU/mL和1.89×1010CFU/mL，芽孢率为94.5%，当补加15 g/L糖蜜时，活菌数和芽孢数均显著下降（P＜0.05），由此可见，10 g/L的糖蜜添加量最有利于枯草芽孢杆菌的生长和芽孢的生成。

2.4 最佳发酵策略的确定

5 L发酵罐接种10%，调节风量0.2 vvm，转速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，发酵pH全程控制在7.5，37 ℃发酵12 h后提高温度到39 ℃直至发酵结束，且在第12 h一次性补加10 g/L的糖蜜，从第12 h开始，每隔3 h取样，检测活菌数和芽孢产量，并确定最佳发酵时长，发酵结果如图8所示。

图7 枯草芽孢杆菌在最佳发酵条件下发酵结果

由图7可见，随着时间的增加，活菌数量逐渐增加，发酵15 h后，芽孢数成对数增长，活菌数和芽孢数持续增长到30 h且达到最大值，分别为3.0×1010CFU/mL和2.9×1010CFU/mL，芽孢率为96.7%，随后活菌数和芽孢率均有所下降，说明发酵已经到达菌体生长末期，所以应在30 h停止发酵。实验说明，在发酵对数前期设置温度37 ℃提高总活菌数，在发酵对数中后期提高温度至39 ℃刺激芽孢生成，并一次性补加糖蜜，延长枯草芽孢杆菌的生长周期，增加活菌总量和芽孢量，效果较好。

2.5 直投菌剂在粮食加工副产物DON降解中的初步应用

将发酵液pH调节为3.5，向其中加入20%（w/v）的膨润土并充分搅拌，喷雾干燥机进风温度160 ℃，出风温度70 ℃，风速30 m3/h，以进料量10 mL/min进行喷雾干燥，制成直投菌剂，菌剂生物量≥1 000亿/g，含水量≤5%。

2.5.1 直投菌剂降解不同粮食加工副产物中的DON

直投菌剂以0.2%（w/v）的接种量接到物料培养基中，30 ℃，220 r/min条件下发酵培养15 h，取样烘干测定物料中DON含量，降解效果如图8所示，该直投菌剂在玉米稀浆和复合物料中的降解效果较好，降解率均在90%以上，DON残留量在500 μg/kg以下；在小麦麸皮、玉米皮、玉米蛋白粉和玉米胚芽中的降解效果相对减弱，但降解率也在50%以上，其原因可能是物料中的营养成分以单一碳源或氮源为主，菌体生长状态没有复合物料生长状态好；而降解菌在玉米浓浆中的降解效果较差，DON降解率低于10%，分析其原因可能是在玉米浆中无机盐含量较高，不利于该芽孢杆菌的生长。该菌在粮食加工副产物DON发酵降解的应用中效果较好，具有较广泛的应用前景。

图8 直投菌剂降解不同物料中的DON

2.5.2 直投菌剂接种量对粮食加工副产物DON降解的影响

分别将直投菌剂以0.01%、0.1%、0.5%、1%的接种量接到复合物料培养基中，37 ℃，220 r/min条件下培养15 h，取样烘干测定物料中DON含量，DON降解率如图9所示，随着直投菌剂接种量的增加，DON的降解率也随之增加，当菌剂接种量为0.01%，DON的降解率为62.2%，当添加量为0.1%时，降解率为92.7%，添加0.5%和1%时，DON降解率分别为96.3%和98.8%。接种量在0.1%以上时，DON降解率均达到90%以上，DON残留量在500 μg/kg以下，说明0.1%以上的菌剂接种量可以较好地降解物料中的DON。

图9 直投菌接种量对物料中的DON降解的影响

2.5.3 物料培养基中不同干物质含量对菌剂降解粮食加工副产物DON的影响

分别将直投菌剂以0.1%接种量接到不同干物质含量的复合物料培养基中，置于30 ℃，220 r/min条件下发酵15 h，取样烘干测定物料中DON含量，结果如图10所示，当物料培养基干物质含量在20%以下时，DON降解效果较好，降解率均在90%以上，DON残留量在500 μg/kg以下，当干物质含量为30%时，降解率显著降低（P＜0.05），降解率为55.1%，并且随着物料培养基中干物含量的增加，降解率随之下降，分析其原因，物料培养基中干物含量高，导致溶氧不足，降解菌只能在初期生长后便无法继续增殖，从而无法有效地降解物料中的DON。由此可见，物料培养基中水分含量高，更有利于降解菌发挥作用。

图10 不同干物质含量的物料培养基对直投菌剂降解DON的影响

3 讨论

孙梅、宋卡魏等[20-21]的研究中表明高溶氧有利于枯草芽孢杆菌的生长和芽孢的生成，所以在本研究中，将溶氧控制在30%以上，而以发酵温度、pH、补料碳源及补料量等作为优化条件研究其对枯草芽孢杆菌产芽孢的影响。在郭夏利、王法富等[11-12]的研究中，主要研究摇瓶中初始pH对枯草芽孢杆菌产芽孢的影响，未对整体发酵的pH进行监控，而本研究结果表明，当全程pH控制在7.5，更有利于芽孢的生成，提高芽孢产率。通过分阶段控温发酵，即在发酵前12 h的对数期将温度控制在37 ℃，利于菌体生长，而12 h后将温度调高到39 ℃，更有利于枯草芽孢杆菌生成芽孢，这与文献报道的结果有所区别[20-21]。此外，在本研究中整体发酵时间均少于报道中[22-23]的发酵时间，更加利于工业生产缩短发酵周期，降低工业能耗。

速效碳源有利于枯草芽孢杆菌的生长[24]，但是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源对枯草芽孢杆菌产芽孢的影响不大，这与郭荣君等[25]的部分研究成果相一致。在本研究中，将糖蜜作为补料碳源添加到发酵培养基中，总活菌数和芽孢生成率均显著提高。糖蜜作为复合碳源，其中含有丰富的生物素和矿物质，而其是促进细胞增长的重要物质，这也从侧面说明了糖蜜既可以促进枯草芽孢杆菌生长又可以促进芽孢的生成。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的存在一直危害着粮油加工、饲料生产及畜牧行业，使这些行业蒙受着巨大的损失，而枯草芽孢杆菌菌剂正在被这些行业广泛地应用。本研究利用发酵罐对降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇直投菌剂发酵制备工艺进行研究并获得最佳发酵策略，增加了芽孢生产率，并且将该菌剂初步应用于污染粮食加工副产物中DON的脱除，效果显著，减少真菌毒素给这些行业带来的困扰。