宫颈癌组织中死亡相关蛋白激酶3 mRNA的表达变化及其临床意义

孟侠，王静依，向睿，刘海凤

核工业四一六医院，成都 610051

我国宫颈癌(CC)每年新发病例数约13.1万例，死亡例数约5.3万例，严重威胁女性健康[1]。CC的治疗方法包括手术治疗、放化疗及分子靶向治疗等，但对于中晚期患者治疗效果差，预后不佳，5年总体生存率仅为40%[2]。深入研究CC发生、发展的分子机制，对CC早期诊断、寻找新的治疗药物及预后评估具有重要的意义。死亡相关蛋白激酶3(DAPK3)基因位于染色体19p13.3，是死亡相关蛋白激酶家族的成员，除了N末端催化结构域外，该激酶还具有亮氨酸拉链结构域, 具有促进细胞凋亡的作用[3]。近年来研究表明DAPK3在肾细胞癌[4]、肺癌[5]等多种肿瘤中表达下调，DAPK3通过激活肿瘤细胞中的ERK / c-Myc信号传导来控制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等生物学行为，DAPK3 表达下调后促进肿瘤细胞的增殖及恶性进展[6]。目前关于DAPK3在CC中的表达相关报道较少。我们观察了DAPK3mRNA在CC癌组织及癌旁正常组织中的表达变化，并分析其与临床病理参数的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2014年5月期间于我院诊治的93例CC患者，年龄28～59(43.3±7.5)岁；病理类型：宫颈鳞癌71例，宫颈腺癌22例；肿瘤分化程度为高分化25例，中分化36例，低分化32例；参考2009年国际妇产科联盟FIGO标准[7]为Ⅰ期31例，Ⅱ期36例，Ⅲ期26例；伴淋巴结转移53例，无淋巴结转移40例; 肿瘤浸润深度为浅肌层37例，深肌层56例。纳入标准：①CC诊断经活检病理或术后病理检查确诊;②所有CC患者均为初次诊治，既往无其它抗肿瘤治疗;③患者临床病理及随访资料完整。排除标准：①同时合并其它器官的恶性肿瘤;②合并感染性疾病，如细菌性感染、结核菌感染等;③合并严重心功能衰竭、肝功能衰竭等的脏器功能不全。CC患者93例患者均行肿瘤切除术，术中保存癌组织及癌旁正常组织(距肿瘤边缘2 cm以上)。所有患者自确诊之日起开始随访，每3月随访1次，以门诊或电话方式随访，随访内容包括患者疾病进展情况及生存情况等。随访截止日期2019年5月，随访1～60个月，中位随访时间47.2个月。

1.2 癌组织及癌旁正常组织DAPK3 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法。取约50 mg癌组织及癌旁正常组织标本，TRIzol法提取总RNA，溶于50 μL DEPC水中，Narodrop上检测RNA浓度。以总RNA为模板，进行逆转录合成cDNA，实验步骤严格按照逆转录试剂盒说明书进行。DAPK3正向引物序列：5′-GCACGACATCTTCGAGAACAA-3′，反向引物序列：5′-CTTAGAGTGCAGGTAGTGAACG-3′，内参基因GAPDH上游序列:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列: 3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。荧光定量PCR反应条件为：95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，变性退火延伸40个循环。以GAPDH为内参， 以2-ΔΔCt代表DAPK3 mRNA的相对表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

CC癌组织与癌旁正常组织中DAPK3 mRNA的相对表达量分别为0.62±0.19、1.75±0.46，癌组织中DAPK3的相对表达量明显低于癌旁组织(t=26.271，P<0.05)。

DAPK3 mRNA表达与CC患者肿瘤FIGO分期、分化程度有关(P均<0.05)，而与患者年龄、病理类型、肿瘤浸润深度及是否伴淋巴结转移无关(P均>0.05)，见表1。

表1 不同病理参数的CC患者宫颈癌组织中 DAPK3 mRNA 相对表达量比较

93例CC患者共随访1～60个月，中位随访时间47.2个月，随访期间无失访病例，随访期间死亡25例。以DAPK3 mRNA相对表达量平均数0.62为临界值，分为高DAPK3 mRNA表达者46例、低DAPK3 mRNA表达者47例，低DAPK3 mRNA表达者5年总体生存率(OS)为60.9%(28/46)，显著低于高DAPK3 mRNA表达者5年OS 85.1%(40/47)(χ2=3.984，P=0.041)。

3 讨论

CC是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，发病率占所有恶性肿瘤的13%[8]，女性肿瘤发病率仅次于乳腺癌。目前CC的主要治疗方式包括手术治疗、化疗、放疗及联合治疗等，但对于晚期转移性患者治疗效果差，部分患者药物治疗不敏感或接受治疗一段时间后肿瘤出现耐药，严重影响患者生活质量及长期生存[9]。因此，有必要深入研究CC的发病机制，寻找有意义的诊断治疗靶点。肿瘤的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，肿瘤的发生发展是一个多步骤的发展过程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活及基因表达调控失常等，进而引起细胞内丝裂原活化的蛋白激酶途径、Wnt通路等细胞信号传导通路异常活化，导致细胞获得无限增殖、转移、促血管生成及免疫逃逸等肿瘤学特征[10]。

DAPK3基因编码蛋白具有丝苏氨酸蛋白激酶的活性，参与细胞内的各种信号传导的激活。近年来研究报道，DAPK3是一种生长抑制性因子，如在3D形态发生模型中，通过慢病毒介导的敲除DAPK3表达后，腺泡细胞增殖加快，凋亡减少，腺泡大小增大，并且保持良好的腺泡极性[11]。此外，在子宫内膜癌的研究中发现DAPK3表达降低能够激活癌基因c-myc的表达，促进肿瘤的恶性进展，与患者不良预后有关[11]。本研究中，CC癌组织中DAPK3 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织，表明CC癌组织中DAPK3 mRNA表达下调，其机制可能与肿瘤发生时DAPK3基因启动子区的表观遗传学修饰有关。研究[12]表明，肿瘤细胞中DAPK3基因启动子区CpG岛处存在高甲基化的现象，DAPK3基因启动子区的甲基化修饰导致基因表达沉默。此外，尚有研究[13]表明肿瘤中DAPK3 基因存在T112M、D161N及P216S的非同义点突变，三种突变均降低或消除其激酶活性，功能丧失突变可促进细胞存活、增殖、细胞聚集和对化疗的抵抗力。本研究中，FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期、低分化患者癌组织中DAPK3 mRNA相对表达量明显较低，表明DAPK3 mRNA表达与肿瘤FIGO分期、肿瘤分化程度有关。其机制一方面可能是DAPK3表达降低后，结果对miR-17/20a表达的促进作用减弱，miR-17 / 20a降低后，导致E2F等细胞周期相关转录因子表达增加，促进肿瘤细胞恶性增殖，肿瘤分期升高[14]。另一方面，肿瘤细胞中AKT信号通路激活，对DAPK3表达具有负向调控作用的同时[15]，AKT同时激活上皮间质转化信号通路的关键转录因子TWIST等，导致肿瘤细胞分化程度降低，肿瘤分级越低[16]。因此，DAPK3可能参与CC发生发展的过程，与患者生存预后有关。本研究中进一步分析不同DAPK3表达水平患者5年总体生存率的差别，结果表明低表达组患者5年总体生存率明显较差，表明CC癌组织中DAPK3的表达水平可能有助于判断患者生存预后，有可能成为CC患者预后评估的肿瘤标志物。但目前CC癌组织中DAPK3表达的具体作用机制尚不明确，有待深入研究，寻找有效的临床诊断和治疗的治疗方案。

综上所述，CC癌组织中DAPK3 mRNA表达降低，DAPK3 mRNA表达与CC患者肿瘤FIGO分期、肿瘤分化有关，低表达DAPK3与患者的不良生存预后有关。DAPK3可能参与了CC的发生、发展。DAPK3可能成为新的CC诊断、治疗及预后评估的肿瘤标志物，但其具体作用机制尚有待深入研究。