碳酸钙和壳聚糖联用对高pH 值石灰性土壤砷污染的钝化

焦常锋，常会庆，王启震，吴 杰，朱晓辉，王 浩

（河南科技大学农学院，洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室，洛阳市植物营养与环境生态重点实验室，洛阳 471023）

0 引 言

砷（As）是中国生态环境部五大重点监控的金属污染元素之一。由于含砷矿物的开采，含砷农药如甲基硫砷、稻宁等的大量施用以及污泥农用等人为活动向土壤中输入大量的砷，并通过吸附沉淀、离子交换、络合、氧化还原等反应使土壤中的砷含量不断上升。2014 年，生态环境部发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国土壤砷的点位超标率高达2.7%，在8 大重金属中仅次于镉（7%）和镍（4.8%）。污染土壤中砷容易被农作物吸收并在可食用部分累积，不仅导致农作物产量下降，而且通过食物链危害人体健康[1-2]。

土壤酶活性对环境变化敏感，易受外界环境和土壤性质的影响，并与重金属污染的种类和污染程度存在一定的相关性，土壤酶特征指标变化可以快速反映出土壤重金属污染的毒害效应。因此，重金属对作物产生明显毒害之前，可以借助土壤酶灵敏地反映出土壤生化反应的方向和强度[3]。

砷（As）在土壤环境中多以五价砷酸盐[Arsenate，As（Ⅴ）]和三价亚砷酸盐[Arsenite，As（Ⅲ）]等无机阴离子的形式存在[4-5]，并且As（Ⅴ）是土壤中主要的存在形式[6]。砷的毒性效应不仅与其总量有关，更大程度上取决于它的化学形态及相应含量[7]。因此，为了消除土壤砷污染的毒害影响，经常使用钝化剂的方法来降低其生物有效性。钝化剂修复方法具有操作容易、成本低、对土壤环境扰动小等优点[8]，碳酸钙等碱性材料钝化剂通常通过提高土壤pH 值来修复酸性土壤中Cu、Pb、Cd 等重金属的污染[9-10]。壳聚糖作为一种天然高分子有机碳化合物，其丰富的官能团对多种正价态重金属离子起到络合而减少土壤对重金属吸附，然后结合植物修复方法达到去除重金属的目的[11-12]。

土壤pH 值和Ca、Fe、Al 等元素的含量都会对As的效态性产生影响。土壤pH 值升高时，土壤胶体上的正电荷减少，通常会导致带负电荷的砷酸根更多地游离在土壤溶液中，因此会导致土壤中As 有效性提高。但另一方面石灰性土壤中含有大量Ca，极容易与As 形成Ca-结合态As，从而降低其有效性。并且大量研究已表明与pH 值和碳酸钙含量较低的土壤相比，由于高pH 值石灰性土壤中碳酸钙等碳酸盐的含量高，容易使土壤Ca-结合态As 有增加趋势[13-14]，但高pH 值石灰性土壤上再添加碳酸钙能否对砷污染起到钝化作用缺乏研究，尤其碳酸钙和壳聚糖联用对砷的钝化效果如何还少有报道。因此，本研究选择高pH 值石灰性土壤为研究对象，以土壤酶活性的变化表征砷污染影响，通过探究碳酸钙和壳聚糖联用对砷污染的钝化效应，旨在为该类土壤的安全生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验地点

本试验在河南科技大学农场开展，该农场位于河南省西部的洛阳市（34°41′N；112°27′E），试验点地处温带大陆性季风气候，年均气温12.2～24.6 ℃，无霜期210 d 以上，年降水量、日照和年均湿度分别为528～800 mm、2 200～2 300 h 和60%～70%。

1.2 供试材料

供试土壤的理化性质见表1。供试作物为夏玉米，品种为郑单958。供试钝化剂采用碳酸钙（Ca）和壳聚糖（C），工业生产的碳酸钙等碱性类钝化剂成本低廉，常被作为酸性土壤的改良剂使用，壳聚糖作为一种天然的高分子有机物，可由沿海地区低廉和丰富的虾壳、蟹壳和牡蛎壳等原料制备。

1.3 试验设计

田间试验采用随机区组设计，共设置4 个处理：1）对照（CK）：土壤中既不添加外源砷，也不添加任何钝化剂；2）砷污染（As）：1 kg 土壤中添加外源砷80 mg，不添加钝化剂；3）砷污染+碳酸钙（As+Ca）：1 kg土壤中添加外源砷80 mg 与钝化剂碳酸钙2 g；4）砷污染+碳酸钙+壳聚糖（As+Ca+C）：1 kg 土壤中添加外源砷80 mg、碳酸钙2 g 和壳聚糖1.2 g。每个处理重复3 次，每个处理的小区面积为2 m2。

砷污染土壤的培养：利用砷酸钠为外源砷，砷污染水平设定为土壤环境质量标准（GB 15618—2018）的筛选值和管控值之间（1 kg 土壤含有砷80mg）。播种前90 d进行砷污染老化处理，首先把小区0～20 cm 土壤层全部移入到不透水的塑料膜上，通过人工翻堆使相应浓度的砷溶液与表层土壤混合均匀，然后再回填到相应小区中。

钝化剂和肥料的施用：种植玉米前（6 月份）在相应小区中添加碳酸钙和壳聚糖[10-11]，同时每个处理添加尿素（1 285 kg/hm2）、过磷酸钙（570 kg/hm2）和氯化钾（240 kg/hm2）作为基肥。

1.4 样品采集与分析

10 月份玉米成熟后，采集土壤样品，风干后分别过0.85 和0.12 mm 的土筛备用。土壤基本理化性质测定参照《土壤农业化学分析方法》[15]。土壤中不同形态砷的提取参照石灰性土壤中砷形态分级方法[16]：分为水溶态、交换态、钙结合态（钙-砷）、铁结合态（铁-砷）、铝结合态（铝-砷）和残渣态等形态（提取剂分别采用H2O、CH3COOH、H2SO4、NaOH、NF4F 和H4ClO4、HF 和HNO3）。提取后的砷采用原子荧光仪进行测定；土壤活性钙为H2O和CH3COOH 提取钙总含量，利用电感耦合等离子光谱仪（Inductive Coupled Plasma Emission Spsctrometer）进行测定。土壤脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶分别采用靛酚蓝比色法测定、3,5-二硝基水杨酸比色法和高锰酸钾滴定法测定。玉米样品砷的测定：玉米收获后，将其根、茎、叶和籽粒分别用蒸馏水洗净烘干，称取一定量的上述样品用双氧水-浓硝酸溶液消解，样品消解完全后，酸至近干，加少量稀硝酸溶液溶解后转移定容，利用原子荧光仪进行测定。对照分析已知成分的标准参考土壤和谷物材料（土壤-GBW07440；谷物-GBW10046），要求重金属的回收率达80%以上作为检验上述土壤和作物重金属分析方法的准确性。

1.5 数据分析

采用SPSS 13.0 软件进行相关数据统计，用最小显著性差异法（Least Significant Difference，LSD）进行差异显著性检验（P<0.05）。同时引入以下参数，表征外源砷在土壤中各形态的分布情况及其生物有效性。

式中T1～T6分别表示水溶态、交换态、钙-结合态、铁结合态、铝结合态、残渣态砷质量分数（mg/kg）

表1 土壤基本理化性质 Table 1 Basic physic-chemical properties of soil

2 结果与分析

2.1 土壤-作物主要参数变化

土壤的主要理化参数和根际中钙含量变化都会影响砷的有效态及作物对其吸收[18]。外源As 和碳酸钙的添加可提高土壤pH 值，但壳聚糖的添加降低了土壤pH 值（表 2）。与CK 处理相比，As、As+Ca 和As+Ca+C 处理分别显著提高了土壤pH 值0.18、0.32 和0.16（P<0.05）。砷污染土壤中碳酸钙-壳聚糖联用与单独添加碳酸钙钝化处理相比，土壤pH 值显著降低了0.16（P<0.05），但与As 处理相比，土壤pH 值降低程度不显著。土壤中有机质变化受外源重金属的影响，土壤As 污染会减弱石灰性土壤中有机物质的矿化速率，增加土壤有机质的积累[19-20]，与CK 处理相比，各As 污染处理的有机质含量有所提高，其中As 处理的有机质含量显著提高了0.7%（P<0.05）。添加钝化剂碳酸钙有利于增加土壤中碳酸盐的含量，As+Ca 处理与CK 相比，土壤碳酸钙含量显著增加，但As 污染各处理的碳酸钙含量差异不显著。和CK处理相比，砷污染会显著降低土壤活性钙和玉米根系中钙的含量，但碳酸钙钝化后会显著增加土壤活性钙和玉米根系钙的含量，尤其As+Ca+C 处理与As+Ca 相比，土壤活性钙和玉米根系钙分别显著增加了0.52 和0.13 g/kg（P<0.05）。

表2 土壤-作物相关参数比较 Table 2 Comparison parameters of soil-crop

2.2 钝化剂添加对土壤砷形态的影响

砷在土壤中的形态变化反映了砷的活动能力以及被作物吸收的程度。表3 为不同处理条件下土壤中各形态As 的含量。CK 处理中，水溶态和交换态As 之和小于0.2%，残渣态As 所占比例在99%以上，可见高pH 值石灰性土壤上As 的主导形态为残渣态。与CK 相比，加入外源As 后，土壤中6 种形态的As 含量均有所增加，且各处理中仍以残渣态As 的含量最高。研究中各处理的水溶态As 含量差异显著（P<0.05），As 污染的各处理中，钝化剂的施用有利于水溶态As 含量的降低，尤其碳酸钙与壳聚糖联用显著降低土壤中水溶态砷的含量。与As 处理相比，As+Ca 和As+Ca+C 处理的水溶态砷分别显著降低17.15%和27.03%（P<0.05）；As+Ca+C 处理的钙-砷、铁-砷和铝-砷分别显著升高了13.97%、14.24%、13.85%。可见高pH 值石灰性土壤上加入钝化剂后，依然可以促使土壤中As 向难于作物吸收的形态转化。通过公式（2）计算可知，碳酸钙、碳酸钙与壳聚糖联用对砷污染的钝化率分别达9.78%和18.73%。因此，碳酸钙和壳聚糖联合使用可以对高pH 值石灰性土壤上As 污染起到较好钝化效果。

表3 不同处理各形态砷的含量 Table 3 The content of different fraction arsenic in different treatments (mg·kg−1)

2.3 钝化剂添加对玉米砷积累的影响

添加钝化剂会对玉米根、茎、叶和籽粒的As 含量及其富集系数产生影响（表4）。砷污染会导致玉米各部位As 含量的增加，各部位As 含量的大小表现为：根>叶>茎>籽粒，与CK 相比，外源As 的添加会显著增加籽粒中的As 含量，但是玉米籽粒As 含量没有超出食品安全国家标准《GB2762—2017》的规定值，且与As 处理相比，As+Ca 处理会显著降低玉米籽粒和茎秆中的As 含量，而As+Ca+C 处理则显著降低了玉米籽粒、根、茎、和叶等部位的As 含量（50%、13.98%、16.51%、14.94%）。As+Ca+C 和As+Ca 处理相比，玉米上述各部位的As 含量显著降低了20%、11.09%、8.08%、11.38%。另外，外源As 污染改变了玉米各部位对As 的富集系数，和As 处理相比，碳酸钙的添加显著降低了籽粒和茎对As 的富集系数。碳酸钙和壳聚糖联用较单独的碳酸钙添加处理可显著降低玉米各部位对As 的富集系数。可见，As 污染石灰性土壤上种植玉米配合钝化剂的施用更有利于其安全生产。

表4 玉米各部位的砷含量及富集系数 Table 4 Content and enrichment coefficient of arsenic in various parts of maize

2.4 土壤酶活性及与各形态砷的相关关系

土壤脲酶活性在一定程度上可反映土壤有机态氮向有效态氮的转化能力和土壤无机氮的供应能力；土壤纤维素酶是土壤碳循环中一种重要的酶，可以用来评价土壤中有机质含量[21]；土壤过氧化氢酶可以用来指示土壤重金属的污染程度[22]。因此，本研究选择上述酶活性变化来表征外源砷污染对土壤的毒害影响（表5）。与CK处理相比，As 污染条件下土壤脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性受到抑制，且分别显著降低了37.9%、50.0%、10.2%。添加钝化剂后，As+Ca 和As+Ca+C 处理的脲酶、纤维素酶、过氧化氢酶活性分别恢复至CK 处理的81.84%和94.62%，86.20%和87.60%，93.37%和97.59%。与砷污染处理相比，碳酸钙和壳聚糖联用使土壤脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性分别显著提高了52.35%、74.92%、8.72%（P<0.05）。可见，加入钝化剂可有效缓解As 污染对上述土壤酶的毒害作用，而且碳酸钙和壳聚糖联用的效果要好于单独添加碳酸钙的效果。土壤各形态砷与3种酶活性都呈负相关关系（表6），其中水溶态As 与3种酶呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）负相关关系，交换态 As 与尿酶和纤维素酶呈显著负相关关系（P<0.05），其余各形态As 与土壤3 种酶活性之间的相关性不显著（P﹥0.05），可见土壤水溶态和交换态As是影响3 种土壤酶的主要As 形态。

表5 不同处理土壤脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性 Table 5 Urease, cellulase and catalase activities in different treatments

表6 土壤酶与土壤各形态砷的相关关系 Table 6 Correlation between soil enzymes and soil arsenic

3 讨 论

3.1 土壤pH 值影响砷的吸附，土壤组成决定砷的形态

土壤对As 的吸附受pH 值影响显著，在pH 值2～11之间，As（V）主要以H2AsO4-和HAsO42-的形式存在，pH 值≤5 时，土壤胶体上带正电荷较多，使土壤吸附As的能力增强[23]；当pH 值>5 时，随着pH 值的增大，土壤胶体上所带负电荷增多，会使土壤吸附As 的能力减弱。所以随着pH 值增大，通常土壤砷的迁移能力增强[24]。当外源砷进入土壤后，其形态变化与土壤组成密切相关，在酸性土壤中Fe-As 和Al-As 含量要远高于Ca-As[14]，但在石灰性土壤中由于CaCO3、盐基离子饱和度比酸性和中性土壤高，而Fe 和Al 含量要远低于酸性和中性土壤，故此石灰性土壤中的Ca-As 是主导的砷形态[25]，即便是外源砷污染在石灰性土壤中只老化了30 d，Ca-As 的含量依然较高。原因在于外源As 在土壤中最佳缓冲阶段是9～17d[26]，无论三价或五价砷进入土壤后，都会迅速与土壤中的Ca、Fe、Al 等离子或氧化物发生沉淀反应，故此其水溶态的含量通常较低，尤其在石灰性土壤中有效态砷含量通常小于1%[16]，本研究也得到相似的研究结果。因此作者认为酸、碱性不同土壤对砷的有效性影响，并不是简单依据pH 值的大小去做出结论，而且要综合考虑和砷酸根离子所结合金属离子的绝对含量及其相对丰度。

3.2 钝化剂添加对碱性土壤As 形态影响

本研究发现，外源As 添加高pH 值石灰性土壤后，其形态仍然以残渣态为主，且其含量占总量的60%以上，其余各形态含量的大小顺序依次为钙-砷、铁-砷、铝-砷、交换态和水溶态。可见高pH 值石灰性土壤上盐基离子（如钙）与As 的复合沉淀依然是主导的土壤过程。已有研究表明石灰类钝化剂的添加能降低土壤中As 的浸出，主要原因是Ca 能与土壤交换态As 形成难溶的As-Ca 络合物砷酸氢钙（CaHAsO4）和砷酸钙［Ca3(AsO4)2］沉淀[27-28]，杜彩艳等[29]也发现土壤中利用钝化剂后提高土壤pH 值的同时，降低了土壤中有效态As 和玉米籽粒As含量。本研究同样发现As 污染石灰性土壤加入碳酸钙后提高了土壤的pH 值，但土壤中有效态As 和玉米籽粒As含量的降低。原因在于在高pH 值石灰性土壤上添加碳酸钙后，可以增加土壤中的活性钙和玉米根系中钙的含量（表2），而增加的土壤活性钙与有效性砷形成Ca-As 沉淀，使土壤中有效态砷含量降低（表3）。玉米根系中增加的钙也会使As 离子沉积在根系，从而有利于玉米籽粒As 含量的降低。

壳聚糖等电点位是6.3，在pH 值>6.3 时，壳聚糖上丰富的氨基、羟基和酰氨基带负电荷，可以和土壤胶体上的钙等碱土离子结合[30]，从而提高土壤中吸附态的碱土离子的解析率，达到增加土壤中有效态钙离子作用（表 2），另外碳酸钙的施用同样会增加土壤Ca2+，上述原因增加的有效态钙离子通过和 As 形成沉淀Ca-As 最终起到联合钝化作用（表3）。该机制通过测试分析不同处理间土壤中活性钙离子的含量加以证明，壳聚糖类似效应也已在文献中得到证实[31]。故此，碳酸钙和壳聚糖联合施用可以起到对外源砷更有效的钝化作用。

3.3 钝化剂添加改善土壤酶活性

本研究中外源As 的污染程度已经超过了土壤筛选值，但作物籽粒中As 含量并没有超出国家规定的食品卫生标准《GB2762—2017》。因此，单纯分析土壤-作物的As 含量很难全面衡量砷污染对土壤质量和作物的影响。土壤酶在土壤养分循环、物质和能量转化等过程中有重要作用，同时土壤酶活性是衡量土壤生物学活性和土壤生产力的重要指标[32]。As 污染降低土壤酶活性主要原因是砷进入土壤后与酶的活性中心或与酶分子的巯基、胺基和羧基的结合形成络合物，致酶分子结构发生改变，从而影响其活性[33]。另外，As 可能抑制土壤中微生物的生长繁殖，进而使土壤酶的分泌和合成减少，导致土壤酶活性降低[34]。虽然土壤中交换态和水溶态As 含量较少，但它们对生物的有效性比其他形态的As 更大，钝化剂的施加降低了有效态砷的含量，有利于微生物的生长和代谢，提高脲酶活性，缓解了As 对土壤酶活性的毒害作用[35]。周丹等[36]对As 污染农田土壤的研究表明：土壤脲酶活性、过氧化氢酶活性与总砷、可利用态砷都呈显著的负相关。本研究砷的污染使得石灰性土壤的脲酶、纤维素酶及过氧化氢酶的活性呈现降低趋势，说明该污染程度已经对土壤生物活性产生不利影响，添加碳酸钙或碳酸钙和壳聚糖后，上述酶的活性均有所提升，说明钝化剂施用有利于缓解高pH 值石灰性土壤上As的毒害。

4 结 论

1）该研究的As 污染浓度会对高pH 值石灰性土壤的脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性产生不利影响，碳酸钙和壳聚糖联用可以有效缓解As 污染对上述参数的影响，使土壤脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性分别显著提高了52.35%、74.92%、8.72%（P<0.05），且施用效果优于单施碳酸钙处理。

2）高pH 值石灰性土壤上碳酸钙和壳聚糖联用可以更好起到对As 污染的钝化作用，其对砷污染的钝化率达18.37%，该钝化效果表现为显著降低土壤中水溶态As 和玉米各部位As 的含量分别显著降低27.03%和50%（P<0.05），同时Ca-As、Fe-As 和Al-As 含量显著增加。因此，玉米种植配合上述钝化剂施用，可实现砷污染高pH 值石灰性土壤的安全生产。

碳酸钙和壳聚糖都具有易得廉价等优点，由于碳酸钙相比其他石灰类钝化剂其施用不会导致土壤pH 值有较大幅度的变化，尤其适合在石灰性土壤上大面积应用；壳聚糖与其他的化学螯合剂相比，它在环境中的危害较小，容易降解，能够被植物吸收利用，因此碳酸钙和壳聚糖联合大面积的应用具有较大潜力。