医用一次性防护服生物负载量检测技术研究

辽宁省检验检测认证中心 （辽宁 沈阳 110036）

内容提要：目的：医用一次性防护服生物负载量检测技术研究。方法：采集2020年2月～3月辽宁省4家医用一次性防护服企业生产的4种材质共5批73件产品，参考GB/T 19973.1-2015《医疗器械的灭菌 微生物学方法第一部分：产品上微生物总数的测定》、EJ/T 1243-2017《确认辐射灭菌剂量的生物负载数据分析方法》、GB 18280.2-2015《建立灭菌剂量》的标准，对样品采集技术适用性、回收率、修正系数进行考查。结果：三种采集技术中质量法适用于医用一次性防护服负载量检测；实验回收率和修正系数的正确应用对辐照灭菌剂量影响较大。结论：生物负载值反映了生产企业的生产环境状况和质量管理水平，生产企业应加强生产过程的质量控制。

生物负载量是建立灭菌剂量的关键值，既决定了辐照成本的高低，又反映了企业生产质量控制水平。如果在产品确定灭菌参数时，收集的生物负载数据不准确，会直接影响产品的灭菌。不同的医疗器械和防护用品不能只确定一种技术方法来检测，必须通过方法适用性实验，调整不同的实验参数，评价所用检测标准和检测方法的适宜性，才能得到对质量控制工作有意义的生物负载数据[1,2]。本项目通过对医用一次性防护服采集技术适用性的考查、实验修正系数和回收率测定，得到的用于建立灭菌剂量的生物负载数据，是对医用一次性防护服生物负载检测方法的一次全面考查。

1.材料与方法

1.1 一般材料

样本来源：采集2020年2月～3月辽宁省4家医用防护服生产企业的4种材质共5批73件医用一次性防护服产品，按照不同生产场地不同生产批次进行分组，设立检测组、观察组以及对照组。检测组：生物负载测量实验；观察组：污染趋势分析；对照组：30kGy辐照，无菌保证水平为10-6。

仪器与试剂：恒温培养箱（Binder-KB240）；生物安全柜（NUAIRE-NU-437-400S）；显微镜（莱卡-DM4000B）；实时荧光定量检测系统（BAX Q7）；全自动酶联免疫分析仪（miniVIDAS)；MALDI-TOF全自动高级版微生物质谱检测系统及配套试剂（美国BRUKER公司）。

增菌与培养用干粉培养基均为北京路桥技术有限责任公司出品。显色培养基为法国科玛嘉显色培养基，API试纸条为法国梅里埃产品，均购自北京路桥技术有限责任公司。以上培养基试剂均在有效期内使用。

表1.生物负载方法适用性实验

1.2 方法

1.2.1 生物负载测试方法

本实验采用GB/T 19973.1-2015《医疗器械的灭菌 微生物学方法第一部分：产品上微生物总数的测定》中B.4.3平板倾注法。

1.2.2 生物负载方法适用性实验测试方法

依据GB/T 19973.1-2015，向对照组空白样品所选部分接种浓度为10～100CFU/0.1mL的标准菌株（大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC8538、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303）悬液0.1mL，并在生物安全柜正常开启的层流状态下干燥。以此为样品做如下实验：采集方式一（质量法局部）：称重取25g样品到225mL洗脱液；采集方式二（涂抹法局部）：涂抹25cm2样品表面积到225mL洗脱液；采集方式三：在方式一的洗脱液中添加表面活性剂。洗脱液为缓冲磷酸盐液（pH=7.0）。回收率=试验组菌落数/菌液组菌落数×100%[1]。

1.2.3 生物负载数据分析方法与实验依据

EJ/T 1243-2017《医疗器械辐射灭菌确认辐射灭菌剂量的生物负载数据分析方法》[3]。

GB 18280.2-2015《医疗保健产品灭菌 辐射 第2部分：建立灭菌剂量》[4]。

《国务院应对新型冠状病毒感染的肺炎疫情联防联控机制医疗物资保障组关于疫情期间执行<医用一次性防护服辐照灭菌应急规范（临时）>的通知（肺炎机制医疗保障发[2020]112号）》[5]。

1.3 检验项目

非选择性需氧菌：菌落总数、大肠菌群测定。

真菌：霉菌和酵母菌。

致病菌：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞、蜡样芽胞杆菌。

1.4 观察指标与判定标准

①生物负载方法适用性：对于一特定产品，采集存活微生物是方法的一部分，应考虑采集效率，对该产品的采集技术进行适用性的考查。用上述三种采集方式，分别计算回收率，评价医用一次性防护服生物负载方法适用性方法。②回收率：将样品按照多次洗脱方式回收微生物，每重复一次，将产品上的洗脱液全部回收并计数，直到回收数量没有明显增加为止，计算方法回收率。③修正系数：本项目采用的质量法，因考虑到采集的局部样本数据代表性问题，应考虑整体样本均匀性，因此，将局部采样得到的负载值数据与直投式采样的负载数据进行比较，得到均匀系数（SIP），结合回收率最后得到修正系数（修正系数=均匀系数/回收率）。④生物负载值测定与分析：将实验原始数据经修正后得出生物负载数值，再运用极差控制图分析数据最后得到用于灭菌剂量确认的生物负载数据[3]。⑤灭菌剂量。

表2.回收率测定

2.结果

2.1 生物负载方法适用性实验

三种采集方式效率相当，按照适用性来说，本项目宜采用质量法。结果见表1。

2.2 回收率测定

回收率测定结果见表2。

2.3 修正系数的完善

本项目得到的均匀系数（SIP）经计算为0.657，因此修正系数为0.73。

2.4 生物负载值测定与分析

生物负载数据见表3，见图1。

2.5 确认灭菌剂量

运用极差控制图后，剔除超差数据，应用质量法计算得平均生物负载为1600 CFU/g，查GB18280.2-2015表4，按照肺炎机制医疗保障发[2020]112号通知的要求，以14.9kGy作为最低灭菌剂量可保证10-3无菌保证水平。见表4。

表3.运用控制图分析用于灭菌剂量确认的生物负载数据

表4.生物负载值修正前后灭菌剂量的差异

图1.生物负载极差图（23个样品组）

3.讨论

3.1 方法讨论

本项目完成了医用一次性防护服生物负载方法适用性考查、实验修正系数和回收率测定，并运用分析方法得到用于灭菌剂量确认的生物负载数据结果。实验结果显示，质量法、涂抹法、添加表活剂法的回收率分别为89%、86.6%、83.8%，质量法操作简单，回收率较高，适用于医用一次性防护服负载量检测；实验回收率和修正系数的正确应用对辐照灭菌剂量影响较大，应用修正值前后灭菌剂量差异较大，应正确使用修正值。

3.2 结果讨论

生物负载值反映了生产企业的生产环境卫生状况以及质量管理水平。本项目采集了辽宁省4家医用一次性防护服生产企业产品，生物负载值差异较大，与生产企业的生产环境相关。医用一次性防护服是医护人员隔离病原微生物的第一道屏障，生物负载实验中检出了金黄色葡萄球菌等致病菌，表明如果不重视产品质量，对医护人员及医院环境都会造成污染危害，不能单纯的认为医用一次性防护服使用的环境非无菌环境而忽略对生产环境的消毒灭菌及产品灭菌环节[6]。产品的灭菌剂量是根据其生物负载水平确定的，灭菌剂量决定了辐照成本的高低，因此生产企业应加强对常规生产产品的生物负载进行质量控制[7]。