正交试验优选黔产锦鸡儿总黄酮的提取工艺

刘 艳 张 慧 熊然英 杨朝莲

贵州省六盘水市食品药品检验检测所，贵州 六盘水 553001

锦鸡儿又名阳雀花，为豆科锦鸡儿属植物锦鸡儿Caraganasinica(Buc’hoz.)Rehd.的干燥根[1]，分布于河北、新疆、山东、江苏、浙江、江西、福建、河南、湖南、四川、云南和贵州等地，具补肺健脾、活血祛风的功效，主治高血压、虚劳倦怠、肺虚久咳、妇女血崩、白带、乳少、风湿骨痛、痛风、半身不遂、跌打损伤[2]。民间药用锦鸡儿属植物主要有锦鸡儿、中间锦鸡儿、藏锦鸡儿等。贵州药用锦鸡儿属植物为锦鸡儿，主要含有黄酮、二苯乙烯、萜类、甾体等成分[3-5]，其中黄酮类成分有抗菌、抗氧化[6]等活性。因此本研究以锦鸡儿总黄酮为质量控制指标，测定黔产锦鸡儿药材中总黄酮含量。目前文献报道锦鸡儿属黄酮的研究主要为施蛟等对中间锦鸡儿黄酮类成分的化学研究、郑敏燕等对藏锦鸡儿总黄酮含量的初步研究及朴惠顺等对小叶锦鸡儿与朝鲜锦鸡儿总黄酮含量的比较研究[7-9]，尚未对黔产锦鸡儿总黄酮进行研究，为了更好地发展贵州民族药，开发利用黔产锦鸡儿，本实验通过正交试验，采用紫外分光光度法进一步研究黔产锦鸡儿总黄酮的最佳提取方法，为黔产锦鸡儿的开发利用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药材 采自贵州省六盘水市、安顺市、兴义市、毕节市、贵阳市、铜仁、凯里、都匀、遵义、威宁等地，经贵阳中医药大学周汉华副教授鉴定为豆科锦鸡儿属植物锦鸡儿Caraganasinica(Buc’hoz)Rehd.的干燥根。

1.2 试药与试剂 芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：10080-201610，UV含量92.6%)。试剂均为分析纯，实验用水均为自制二级纯净水。

1.3 仪器 Thermo Evolution 220紫外分光光度计(赛默飞(上海)仪器有限公司)，ME104E万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，AG135十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，HH恒温水浴锅(江苏中大仪器科技有限公司)，SB-5200DTDN超声波提取器(宁波新芝生物科技有限公司)，DFY-300摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品约20 mg，精密称定，置 100 mL量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解，稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL含无水芦丁0.2 mg)。

2.2 最大吸收波长的确定 取芦丁对照品溶液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，按紫外-可见分光光度法《中国药典》2015年版四部 (通则0401)，于400～800 nm波长范围内扫描。结果芦丁对照品溶液在509.98 nm处有最大吸收，故选510 nm为测定波长。吸收光谱如图1所示。

2.3 标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL容量瓶中，按2.2项下自“加水至6 mL”起，同法操作，分别在510 nm处测定其吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，对照品浓度(mg/mL)(X)为横坐标，计算回归方程得：Y=13.375X-0.0055，r=0.9998。在0.00865～ 0.05189 mg/mL范围内，线性良好。芦丁标准曲线如图2所示。

2.4 正交试验优选提取方法 根据初步试验的结果，乙醇作为提取溶剂，回流提取作为提取方法，选用L9(34)正交试验表，以直接影响总黄酮收率的提取倍数、提取时间、提取次数为试验因素，每个因素3个水平，见表1；对黔产锦鸡儿总黄酮的最佳提取方法进行优选，见表2、表3。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验直观分析表

表3 正交实验方差分析表

由方差分析，该实验因素对实验结果无显著性。所以由直观分析应选择A2B2C3实验方案，即是料液比1∶100倍(50 mL)，回流提取3次，每次60 min。

2.5 验证试验 按照A2B2C3的条件提取3次，进行吸光度测定，其总黄酮含量的平均值为2.83%，RSD为1.18%。由实验结果看出，利用正交实验方法确定的A2B2C3为最佳提取工艺。

2.6 供试品溶液的制备 黔产锦鸡儿药材粉碎过筛，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，称重，水浴回流提取3次，每次60 min，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，合并续滤液备用。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2项下自“加水至6 mL”起，按实验方法操作连续测定6次吸光度，结果为0.324、0.314、0.324、0.329、0.322、0.325，平均值为0.323，RSD为1.54%。表明精密良好。

2.7.2 稳定性试验 精密吸取供试品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2项下自“加水至6 mL”起，同法操作，在显色后0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min在510 nm处测定，其吸光度分别为0.392、0.398、0.403、0.404、0.404、0.405、0.404、0.404、0.403、0.402，平均值为0.402，RSD为0.99%，表明黔产锦鸡儿供试品溶液在90 min内稳定。

2.7.3 重复性试验 黔产锦鸡儿供试品溶液6份，分别取3 mL置25 mL的容量瓶中，按2.2项下自“加水至6 mL”起，同法操作，显色后在510 nm处测定，其吸光度分别为0.364、0.365、0.364、0.371、0.379、0.375，平均值为0.370，RSD为1.73%。结果表明该方法重复性较好。

2.7.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的黔产锦鸡儿样品6份，每份约0.25 g，分别精密加入芦丁对照品6 mg，进行含量测定并计算回收率，结果芦丁的平均回收率为99.50%(n=6)，RSD=1.88%。见表4。

表4 加样回收率试验实验结果

2.8 黔产锦鸡儿总黄酮含量测定 10批黔产锦鸡儿样品按最佳提取条件提取，分别精密量取3 mL置25 mL的容量瓶中，再按2.2项下自“加水至6 mL”起，同法操作，在510 nm处测定吸光度，并计算黔产锦鸡儿总黄酮的含量。结果见表5。

表5 黔产锦鸡儿药材总黄酮含量测定实验结果

3 讨论

从以上实验结果可知，用分光光度法测定黔产锦鸡儿中总黄酮含量简便、快速、准确，可作为黔产锦鸡儿中总黄酮含量的一种方法。

正交试验中通过极差分析得到：极差C>极差A>极差B，因此比较得到影响总黄酮提取因素的主次为提取次数>提取倍数>提取时间。结果表明，黔产锦鸡儿总黄酮的最佳提取条件为：选用乙醇作为溶剂，料液比1∶100倍，回流提取3次，每次60 min ，合并滤液。该工艺合理，可作为黔产锦鸡儿药材中总黄酮的提取方法。

文献报道藏锦鸡儿中总黄酮平均含量为1.64%，小叶锦鸡儿与朝鲜锦鸡儿总黄酮含量均小于1%，安徽产锦鸡儿总黄酮平均含量为3.37%，本实验测得黔产锦鸡儿材总黄酮的平均含量为2.57%，说明锦鸡儿属植物不同种之间总黄酮含量不同，不同产地间锦鸡儿的质量存在一定差异，不同地理环境，生态条件对锦鸡儿药材质量有一定影响。本实验可以为黔产锦鸡儿的开发利用提供科学依据。