南蛇藤总萜类化合物对人脐静脉内皮细胞增殖抑制及诱导凋亡的实验研究

杨庆伟 刘延庆 梁海鹏 陈小鹏 彭世龙

1．甘肃省庆阳市人民医院肿瘤外科，甘肃 庆阳 745000；2. 江苏省扬州大学医学院，江苏 扬州 225009

南蛇藤(Celastrus orbiculatus)为卫矛科南蛇藤属植物[1-2]，我国南蛇藤属植物分布广泛，以长江以南地区多见，仅黔南地区分布就有11种之多。南蛇藤的藤、茎、根、果实均可入药，有祛风除湿、活血解毒及消肿抗炎之功效，民间常用来治疗筋骨疼痛、四肢麻木、风湿性关节炎、腰腿痛、闭经、小儿惊风、痧症、痢疾、跌打损伤等病症。

现代医药研究证实，南蛇藤主要含有二氢沉香呋喃倍半萜和生物碱，此外还有萜类、黄酮类、甾体类及鞣质等多种成份。倍半萜类化合物是从南蛇藤中分离得到最多的一类化学成分，结构类型为二氢沉香呋喃型，由于在基本母核上可形成不同的取代基，因而可形成不同类型的二氢沉香呋喃型倍半萜。二氢沉香呋喃型倍半萜作为南蛇藤主要活性成分之一。三萜类化合物目前发现的4种三萜类化合物分别为南蛇藤素、扁蒴藤素、香树醇酯和β-香树醇酯棕榈酸酯[3]。

近年来，南蛇藤总萜抗肿瘤研究报道较多[4-6]，尤其在消化道肿瘤表现出很好的抗肿瘤活性。南蛇藤总萜对肝癌、胃癌、食道癌等消化道肿瘤系统化研究表明，南蛇藤总萜不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，同时在抑制肿瘤血管生成方面也表现出一定的优越性[7]。本研究观察南蛇藤总萜类化合物(主要为倍半萜类和三萜类化合物)对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响，检测南蛇藤总萜类化合物对基因蛋白Bcl-2和血管内皮生长因子(Vascular Endothetial Growth Factor，VEGF)表达的影响，探讨南蛇藤总萜类化合物诱导人脐静脉内皮细胞凋亡和抑制肿瘤血管侵袭转移的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)由扬州大学医学院医学分子生物研究所提供，用含10%小牛血清的DMEM培养液(另加青霉素100 KU/L、链霉素100 mg/L)于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.2 药物提取 南蛇藤茎经本课题组合作方，中国药科大学王强教授课题组完成萜类化合物的提取及鉴定[8]。提取流程:同批次的南蛇藤藤茎切断，粉碎成粉，烘干，95%乙醇加热回流提取3次，旋转蒸发仪回收溶剂得到浸膏，拌入硅藻土，真空低温抽干，再用乙酸乙酯热水浴加热回流，过滤，回收得到乙酸乙酯浸膏(总萜类化合物含量68.3%)，提取物得率约2%。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM培养基购于Gbico公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自于Sigma公司；小牛血清购自杭州四季青公司；碘化丙啶(PI)购自晶美公司；鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自Abd serotec公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IGg购自碧云天生物公司；人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒购自博士德生物公司；倒置相差显微镜(OLYMPUS)购自日本；CO 2恒温孵箱(REVCO)购自美国；酶标仪(Labsystems Dragon)购自芬兰；流式细胞仪(FACSAria)购自于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人脐静脉内皮细胞置于含有10%小牛血清的DMEM培养液中，在37 ℃、含体积分数为5% CO2的孵箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测药物剂量依赖性 人脐静脉内皮细胞以8×103个/孔接种于96孔培养板中，然后加入不同浓度的南蛇藤总萜类化合物稀释液，使其最终浓度分别为20、40、80、160 μg/mL，对照组用等体积的培养基替代，每个剂量组设6个重复孔。在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养24 h后，每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT工作液，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡器振荡10 min后。选择490 nm波长，在自动酶标仪上测定每孔吸光度(A值)，试验重复3次，计算细胞生长抑制率(IR)=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3 MTT法检测药物时间依赖性 选取浓度为40 μg/mL的南蛇藤总萜作用于人脐静脉内皮细胞24、48、72、96 h，MTT法测定各孔A490 nm值，计算细胞抑制率。对照组用等体积的DMEM培养基替代。具体操作流程和计算方法同上。

1.2.4 流式细胞仪PI单染法检测细胞凋亡 人脐静脉内皮细胞以3×105个/孔接种于六孔培养板中，孵育24 h后加入南蛇藤总萜类化合物稀释液，使其最终浓度分别为20、40、80、160 μg/mL，对照组用等体积的DMEM培养基替代。分别孵育24后，收集细胞，离心去上清， PBS洗涤，转移到EP管中，加入10 μL PI,混匀后于室温下避光10 min，于流式细胞仪上样检测凋亡细胞。

1.2.5 流式细胞仪法检测Bcl-2蛋白表达的变化 人脐静脉内皮细胞以4×105个/mL接种于50 mL的细胞瓶中，24 h后加入按倍数比例稀释后的南蛇藤总萜各浓度(5～20μL /mL)，对照组用等体积的DMEM培养基替代。孵育24h后，收集细胞，调节其浓度为1×106个/mL，取100 μL的细胞悬液放入1.5mLEP管中，然后加入含有1%多聚甲醛的PBS固定10 min，去上清，加入含有0.1%Triton X-100的PBS，室温放置15min，PBS予以洗涤，加入稀释的鼠抗人Bcl-2单抗，予以室温下留置30 min，PBS再次洗涤，吸取弃上清，加入稀释的羊抗鼠FITC-IgG，于室温下避光留置30min，PBS洗涤，最后加入1mL PBS，于流式细胞仪检测。FI(Fluresence Index，FI)计算Bcl-2荧光指数公式如下：FI=检测管细胞平均荧光强度/对照管细胞平均荧光强度。对照管表达FI=1，如FI>1.0为阴性表达，FI<1.0为阳性表达。

1.2.6 ELISA法检测血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化 取对数生长期人脐静脉内皮细胞，以每孔3×106个接种于六孔板子中，37 ℃、5% CO2培养24 h后，加入等体积得南蛇藤总萜类化合物稀释液(终浓度分别为2.5、5、10、20 μg/mL)，继续培养48h后，吸取细胞培养上清于EP管中，离心去除细胞碎片和杂质后，于-80℃冰箱保存备用。上清液中VEGF蛋白浓度测定按照VEGF检测试剂盒进行，于酶标仪450 nm处测吸光度(A值)，根据标准品的A值求出标准曲线方程，并计算出细胞上清中VEGF浓度。

2 结果

2.1 南蛇藤总萜对人脐静脉细胞增殖的剂量依赖性 随着南蛇藤总萜药物浓度分别为20、40、80、160 μg/mL时，南蛇藤总萜对人脐静脉内皮细胞的抑制率分别为6.11%、13.59%、22.48%、29.61%，存在量效关系，与对照组相比存在统计学差异(P<0.05)。详见表1。

表1 南蛇藤总萜作用24 h对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

2.2 南蛇藤总萜对人脐静脉细胞增殖的时间依赖性 选取浓度为南蛇藤总萜40 μg/mL作用于人脐静脉内皮细胞，分别孵育24 h、48 h、72 h、96 h后，结果显示药物作用96 h后，南蛇藤总萜对人脐静脉内皮细胞最大抑制率可达30.06%，南蛇藤总萜抑瘤效果存在时间依赖性。详见表2。

表2 不同作用时间南蛇藤总萜(40μg/mL)对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

2.3 南蛇藤总萜类对人脐静脉细胞凋亡的影响 当南蛇藤总萜浓度分别为20、40、80、160 μg/mL作用人脐静脉内皮细胞24 h后，通过流式细胞法检测凋亡率，凋亡率分别为(4.59±1.32)%、(7.64±0.97)%、(12.26±1.68)%、(19.44±2.34)%。160 μg/mL南蛇藤总萜作用人脐静脉内皮细胞48 h后，细胞凋亡率可达到(23.31±3.42)%。南蛇藤总萜可以诱导人脐静脉内皮细胞凋亡，呈剂量依赖性，并且与药物作用时间呈正相关，与对照组相比存在统计学差异(P<0.05)。详见表3。

表3 不同浓度的南蛇藤总萜类化合物对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

2.4 南蛇藤总萜对Bcl-2蛋白表达的影响 当药物浓度为2.5、5、10、20 μg/mL时，随着药物浓度的不断增大，FI值分别为0.94、0.87、0.77、0.56，FI值在逐步下降，与药物剂量呈一定的相关性，见表4。可以认为南蛇藤总萜类化合物能够下调人脐静脉内皮细胞Bcl-2基因蛋白的表达，与对照组相比，存在统计学差异(P<0.05)。

2.5 南蛇藤总萜对人脐静脉内皮细胞VEGF分泌含量的影响 ELISA结果表明，不同浓度的南蛇藤总萜作用于人脐静脉内皮细胞48h后，能够明显降低细胞上清中VEGF的含量，随着药物浓度成倍数增加，VEGF的含量逐步下降，存在量效关系(详见表4)。与对照组相比，存在统计学差异(P<0.05)。

表4 南蛇藤总萜类化合物对人脐静脉内皮细胞VEGF和Bcl-2 的影响

3 讨论

南蛇藤为卫矛科南蛇藤属植物，具有多种成分及生物学活性，南蛇藤总萜类化合物是南蛇藤属植物重要的抗肿瘤活性成分。近年来研究表明，南蛇藤的有效成分可以通过细胞毒作用、诱导细胞凋亡、逆转肿瘤多药耐药、抑制肿瘤血管生成等多种机制发挥抗肿瘤作用。王海波等[9]报道，南蛇藤乙酸乙酯提取物能够抑制胃癌BGC-803细胞转移，其机制可能与抑制细胞中丝切蛋白的表达有关。白殊同等[10]研究认为，南蛇藤活性成分Nimbidiol在12.5～50 μmol/L浓度范围内，能够有效抑制斑马鱼胚胎节间血管发育和大鼠动脉环周围血管新生过程，具有明显的抗血管新生作用，但其作用机制尚未阐明，推测其作用与抑制 VEGF有关。朱耀东等[11]建立腹腔转移鼠模型，通过不同剂量组南蛇藤提取物的干预，结果证实了南蛇藤提取物能够明显抑制腹腔转移瘤的生长、腹膜种植转移和肝肺转移的发生，呈剂量依赖效应。

本研究选取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，采用不同剂量的南蛇藤总萜干预。结果表明，南蛇藤总萜可以抑制人脐静脉内皮细胞增殖，诱导脐静脉内皮细胞凋亡，存在剂量依赖性和时间依赖性。

细胞的凋亡受众多相关凋亡基因的调控，包括抗凋亡基因如Bcl-2和凋亡促进基因如Bax、Fas等。研究[12]发现Bcl-2基因表达可能是主要的抗凋亡基因，Bcl-2家族蛋白在控制细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，抗凋亡蛋白Bcl-2过度表达常与各种癌症直接相关。本研究通过流式细胞仪法检测人脐静脉内皮细胞Bcl-2蛋白变化，结果证实了南蛇藤总萜能够下调人脐静脉内皮细胞Bcl-2蛋白的表达，存在量效关系。肿瘤血管的生成是一种“乏氧”状态，过度的异常血管生成在肿瘤进展中起着关键作用，这一过程是由组织缺氧引发的血管内皮生长因子VEGF的过量产生，从而导致的促血管生成因子和抗血管生成因子之间的不平衡所驱动[13]。VEGF是体内一种强效的促血管生成因子，能直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的增殖，增强血管通透性，直接或间接的参与血管生成。在本研究中，不同剂量的南蛇藤总萜干预人脐静脉内皮细胞，后取细胞上清液通过ELISA法予以检测，结果证明了南蛇藤总萜能够下调VEGF的表达，存在量效关系。

综上所述，本研究证实南蛇藤总萜能够抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，诱导其细胞凋亡，降低了肿瘤通过血管侵袭转移的可能性，其抑制肿瘤血管生成机制可能与下调Bcl-2和VEGF表达有关，以期为后续研究提供一定的思路。