女阴硬化性苔藓皮损黑素细胞和表皮厚度分析

高小曼 李子媛 孙凯律 常建民

北京医院皮肤科 国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院100730

硬化性苔藓（lichen sclerosus，LS）是一种慢性炎症性皮肤疾病，可发生于全身各部位，其中以女性外阴部位最为常见［1-2］。女阴LS（VLS）多表现为对称分布的瓷白色或灰白色斑片，同时可伴有水肿、糜烂、血疱、紫癜等［3］。由于本病以皮肤萎缩为特征，故以往称为“硬化萎缩性苔藓”，但近年发现，部分病例没有发生皮肤萎缩，故将“萎缩”去除。我们通过分析LS皮损表皮黑素细胞以及厚度变化，探讨LS最为突出的两种临床表现——色素减退和皮肤萎缩可能的病理学机制。

一、对象

VLS 组：2018 年6- 12 月于北京医院皮肤科诊治的15 例成年VLS 患者，年龄19 ～59 岁，经临床及病理活检确诊。根据外阴典型皮损病理表现分为初期组7例和后期组8例。分组标准：初期皮损可见棘层轻度不规则增厚，真皮浅层水肿，但尚无明显均质带形成，大量淋巴细胞浸润，淋巴细胞接近表皮；后期皮损可见表皮角化过度，棘层细胞减少，基底细胞液化，真皮浅层胶原纤维变性形成均质带，其下方大量淋巴细胞呈带状浸润（图1）。

对照组：随机选择2018 年6-12 月于中国医学科学院整形外科医院妇科整形中心行外阴整形手术的15 例成年女性的外阴标本，所有标本经苏木精-伊红（HE）染色证实为正常皮肤组织。术前诊断分别为先天性阴唇肥厚11例、阴蒂包皮过长2例、阴道松弛2例。

本研究符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）的要求，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1.试剂：一抗为大鼠抗人多巴色素异构酶（DCT）多克隆抗体和大鼠抗人细胞角蛋白14（Krt14）单克隆抗体，均由北京生命科学研究所制备，稀释度1∶200。二抗为Alexa Fluor 546 驴抗大鼠IgG（H + L），产自美国ThermoFisher 公司，稀释度1∶500。

2.免疫荧光染色检测黑素细胞、角质形成细胞、表皮全层厚度和表皮细胞层厚度：OCT包埋标本，-80 ℃液氮冷冻，制作16 μm 厚冰冻切片，2.4%多聚甲醛溶液固定标本，0.3%H2O2-甲醇溶液透膜处理，封闭液封闭，加入一抗，4 ℃下孵育8～24 h，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次15 min，加入二抗，4 ℃下孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色30 min，50%甘油-DAPI溶液封片，-20 ℃条件保存。

图1 不同时期女阴硬化性苔藓皮损组织病理（HE×40） 1A：初期可见棘层不规则增厚，真皮浅层水肿，大量淋巴细胞浸润，淋巴细胞接近表皮；1B：后期可见角化过度，表皮萎缩，基底细胞液化，真皮浅层均质带形成，其下方大量淋巴细胞呈带状浸润

用Zeiss-M1 正置荧光显微镜（德国Zeiss 公司）拍摄免疫荧光染色图像。使用Imaris x64 7.4 软件（Bitplane 公司，瑞士）和ZEN blue edition 2012软件（德国Zeiss公司）进行图像处理。在DCT染色切片中计算表皮黑素细胞数与基底层细胞总数的比值作为黑素细胞密度；在Krt14染色切片中测量表皮全层厚度和细胞层厚度，表皮全层厚度为皮肤表面至基底层最下方的垂直距离，表皮细胞层厚度为角质层最下方至基底层最下方的垂直距离。每张切片选择3 个视野，每个视野测量3 组真皮乳头处和表皮突处的表皮全层厚度及表皮细胞层厚度，取平均值。

3.统计分析：应用SPSS Statistics 20软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料比较采用单因素方差分析，LSD-t检验进行组间两两比较；采用Welch′s anova方法比较3组间年龄和表皮细胞层厚度，采用Games-Howell检验对表皮细胞层厚度进行组间两两比较。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

三、结果

1.年龄比较：初期组（39.71±14.33）岁，后期组（35.25±11.20）岁，对照组（30.40±8.14）岁，3 组间差异无统计学意义（F=1.535，P=0.257）。

2.表皮黑素细胞密度：免疫荧光染色显示，黑素细胞分布在表皮基底层（图2）。VLS 初期和后期组表皮黑素细胞密度均低于对照组（t = 4.952、8.203，均P＜0.001），且后期组低于初期组（t=2.560，P=0.016）。见表1。

3.表皮厚度：见图3、表1。3组间表皮全层厚度差异无统计学意义（P=0.487）。表皮细胞层厚度差异有统计学意义（P=0.007），其中，初期组与对照组（t=0.443，P=0.899）和后期组（t=1.484，P=0.354）差异均无统计学意义，但后期组显著低于对照组（t=3.811，P=0.003）。

四、讨论

皮肤色素减退在临床上非常常见，出现的原因可能是原发性黑素细胞结构或功能破坏，如白癜风［4］，或继发于其他皮肤病，如银屑病、接触性皮炎、特应性皮炎等［5-6］。大部分VLS患者可出现色素减退［7］，但机制尚不完全明确，可能是多种原因共同作用的结果，包括：①黑素细胞数目减少；②黑素颗粒产生减少；③黑素颗粒向角质形成细胞转运障碍等［8］。DCT 是黑素合成过程中的一种特异性酶，我们选用DCT 标记黑素细胞，发现正常对照组外阴皮肤表皮黑素细胞密度平均值为0.275，VLS 初期组为0.170，后期组为0.110。无论初期还是后期VLS 表皮黑素细胞密度均较对照组明显减少，说明黑素细胞数目减少是VLS 出现色素减退的机制之一。另外，本研究显示，后期VLS表皮黑素细胞密度较初期减少，提示随着病情进展，黑素细胞在逐渐减少。这一现象的出现可能是VLS 患者皮肤免疫反应诱导产生的多种炎症因子抑制黑素细胞生成或造成黑素细胞损伤、凋亡等所致［8］。而对于VLS皮损中是否存在黑素颗粒产生减少或黑素颗粒向角质形成细胞转运障碍等其他机制，还有待进一步研究证实。

图2 不同时期女阴硬化性苔藓（VLS）皮损表皮黑素细胞荧光染色图 2A：初期VLS；2B：后期VLS；2C：正常对照 图3 不同时期女阴期硬化性苔藓（VLS）皮损表皮角质形成细胞荧光染色图 3A：初期VLS；3B：后期VLS；3C：正常对照

表1 不同时期女阴硬化性苔藓（VLS）表皮黑素细胞密度、表皮厚度（±s）

表1 不同时期女阴硬化性苔藓（VLS）表皮黑素细胞密度、表皮厚度（±s）

组别初期VLS组后期VLS组对照组F值P值例数78 15表皮黑素细胞密度0.170±0.071 0.110±0.035 0.275±0.036 36.426＜0.001表皮全层厚度（μm）203.682±137.997 150.020±70.914 194.030±82.996 0.738 0.487表皮细胞层厚度（μm）154.603±121.984 83.455±37.129 176.974±80.296 7.330 0.007

既往很多研究表明，VLS患者常出现表皮萎缩，但多通过HE 染色证实，仅一项研究测量了VLS 皮损表皮厚度［9］。我们将VLS 病例分为初期和后期两组，测量表皮全层厚度与细胞层厚度，分析表皮细胞增殖与角质层厚度的变化。本研究中所用的ZEN blue和Imaris成像分析软件可直接精确测量皮肤组织切片的直接免疫荧光图像，满足实验对精确度的要求。由于表皮厚度与年龄关系尚不明确，外阴皮肤厚度可能受年龄的影响［10-11］，故我们比较3组受试者年龄，发现差异无统计学意义，提示3组具有可比性。研究结果表明，VLS初期和后期皮损表皮全层厚度与正常皮肤均无明显差异，但随着病情进展，VLS表皮细胞层厚度逐渐减少，提示角质层厚度在逐渐增加。既往有研究显示，VLS表皮的棘细胞层与真皮乳头层厚度较健康人明显变薄［9］，本研究中LS 皮损表皮细胞层厚度减少与上述文献一致。我们推测VLS表皮细胞层减少可能是由于发病过程中免疫细胞产生的炎症介质对基底层细胞产生破坏作用，使基底细胞出现液化变性，从而影响角质形成细胞的正常增殖；而角质层的增厚则可能与搔抓、摩擦等外界因素有关。

本研究表明，初期和后期VLS 表皮黑素细胞密度均较对照组减少，初期VLS 皮损表皮全层厚度和细胞层厚度均与对照组无明显差异，而后期病例表皮细胞层厚度明显减少。但是，外阴结构复杂，不同部位黑素细胞数量及皮肤厚度存在差异，本研究纳入样本量较少，未能区分具体的取材部位，所得结果有一定的局限性，将来还有待开展更多大样本量的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突