miRNA-1246靶向MAPK14在长波紫外线诱导人成纤维细胞光老化中机制的研究

胡翠 李巍 张婷 鲁慧 吴亚芳 钱华

苏州大学附属儿童医院皮肤科215025

长期慢性紫外线照射可诱导皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）合成、线粒体损伤、蛋白质氧化损伤和端粒缩短等，使皮肤加速衰老甚至出现癌变［1-2］。本研究小组前期发现，微小RNA（miRNA）-1246是紫外线照射诱导光老化中出现显著下调的miRNA之一［3］，其靶点基因丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14，又称p38）是MAPK 信号通路关键分子，与MMP 及胶原降解等细胞光老化机制具有密切关系。本研究通过建立长波紫外线（UVA）照射诱导的人皮肤原代成纤维细胞（HSF）的光老化模型，检测miR-1246和MAPK14 的表达，并用慢病毒转染上调miR-1246 的表达，观察其对细胞增殖和光老化的影响，探讨其内在的分子机制。

材料与方法

一、材料与仪器

DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；UVA 照射仪（上海希格玛公司）；Dispase酶、胶原酶（美国Sigma公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen 公司）；MAPK14 鼠单克隆抗体（美国Sigma 公司）；MMP-1 兔单克隆抗体（美国Abcam公司）；增强化学发光试剂（ECL）（美国Bethyl 公司）；山羊抗兔IgG抗体、山羊抗小鼠IgG抗体（上海碧云天生物技术研究所）；人源has-miR-1246 慢病毒表达载体、慢病毒转染试剂盒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），实时定量PCR 试剂盒、SYBR 荧光染料试剂（日本Takara 公司）；ABI7300 实时定量PCR 仪（美国ABI公司）。

二、HSF的分离和培养

HSF分离自本院泌尿外科收集的5例3 ～12岁健康儿童包皮环切术后皮肤标本。本研究通过苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准（批号：2020CS003），患儿监护人均签署知情同意书。

包皮标本用含1%青链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，清除皮下脂肪和血管后，将标本剪成宽为3 mm 的皮条，使用Dispase 酶在37 ℃消化3 ～4 h，分离表皮与真皮。将真皮剪成碎沫后再使用胶原酶于37 ℃消化2 ～4 h。过200 目筛网收集细胞悬液，离心后将细胞重悬于含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM 培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱培养。取对数生长期细胞传代，用于进一步实验。

三、连续UVA照射诱导HSF老化

取对数生长期HSF，加入少量PBS覆盖培养皿底面，置于冰水中，用紫外线治疗仪（型号SS-04，UVA：320 ～400 nm）进行照射，单次照射780 s，剂量为10 J/cm2，照射后弃PBS，重新加入培养基，于次日再次重复操作，连续照射14 d，于首次照射后和照射后第3、7、14天，采用RT-PCR检测miR-1246的相对表达，以相同处理不照射UVA 的细胞为对照。

四、RT-PCR检测目的基因的相对表达

取各实验组细胞，按Trizol 试剂盒方法提取总RNA，反转录获得cDNA。使用SYBR Green I 染料法进行相对定量分析。采用20 μl 反应体系，引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，序列见表1。扩增条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40 个循环。每个样品设3 个复孔，结果取平均值，用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达值。

五、慢病毒转染上调HSF 细胞miR-1246 的表达及验证

取对数生长期HSF 细胞，按照慢病毒转染手册，转染以异硫氰酸荧光素（FITC）标记的miR-1246 慢病毒表达载体至HSF 细胞，慢病毒表达载体的构建和鉴定由上海诺百生物技术有限公司完成，将细胞分为转染FITC-miR-1246 的miR-1246转染组以及转染FITC-miR无义序列的阴性对照组和不做任何处理的空白对照组，观察转染后第7、14 天时细胞的荧光情况以确定转染效率，通过RT-PCR检测miR-1246的相对表达。

六、双荧光素酶报告基因系统验证miR-1246与靶点基因MAPK14结合

通过miRNA 靶基 因 预 测网站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）分析miR-1246 与靶点基因MAPK14的互补序列，由上海诺百生物技术有限公司构建合成有互补序列的野生型（WT）MAPK14及无互补序列的突变型（MUT）MAPK14 荧光素酶报告基因质粒（图1），分别与miR-1246及其空白质粒共转染于24 孔人胚胎肾细胞（HEK293T）培养板，48 h后收取细胞，PBS洗2遍，每孔加100 μl被动裂解缓冲液，水平摇床裂解20 min，吹打均匀，吸取20 μl细胞裂解液于酶标板，加入50 μl荧光素酶分析缓冲液，检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入50 μl 底物缓冲液，立即检测海肾荧光素酶活性，记录前后两次测得荧光数据，其比值代表各孔样本的相对荧光强度，配对程度越高相对荧光强度越低。

七、UVA 照射及上调miR-1246 的表达对HSF细胞的影响

取对数生长期细胞，分为4 组，分别是空白对照组、UVA 组（按照方法三的剂量连续照射）、miR-1246组（转染has-miR-1246）、UVA+miR-1246组（转染has-miR-1246，按照方法三的剂量连续照射），14 d 后，收集各组细胞，采用MTT 检测细胞增殖活性，β半乳糖苷酶染色检测细胞老化，RT-PCR及Western 印迹检测MMP-1、MAPK14 mRNA 及蛋白的表达。

1.MTT 检测细胞增殖活性：取各组细胞，调整为5×104～10×104/ml 的细胞悬液，取100 μl 加入96 孔板，置37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，每组设5 个复孔。更换培养基，每孔加20 μl MTT（5 g/L）溶液，于37 ℃、5% CO2培养箱培养4 h，吸去上清液，加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min，使用酶标仪于490 nm测定各孔吸光度（A值），反映细胞增殖活性。

2.β半乳糖苷酶染色检测细胞老化：取各组细胞，使用PBS清洗后加入适量细胞固定工作液固定细胞，采用PBS 清洗后，加入细胞染色工作液于37 ℃孵育20 min至16 h，至光镜下观察出现蓝染的阳性细胞；弃去染色工作液，用PBS清洗；随机挑选3 处视野，采用德国ZEISS 公司VIDAS 型计算机全自动图像分析系统计算β 半乳糖苷酶表达阳性细胞比率，阳性细胞率（%）= 蓝染细胞面积/细胞总面积×100%。

图1 根据miR-1246与MAPK14基因之间的互补序列设计的互补和不互补序列 野生型（WT）有互补序列，突变型（MUT）无互补序列

表1 引物序列

3.Western印迹检测蛋白表达：取各组细胞，裂解后收集上清液，进行蛋白定量。各组取等量蛋白，经电泳、转膜、封闭，分别与MMP-1 抗体及MAPK14抗体（1∶1 000）孵育过夜；洗涤后与相应的二抗结合反应，使用ECL发光显色，以GAPDH作为参照，目的条带灰度值与GAPDH 条带的比值为相对表达水平。

八、统计学处理

结 果

一、UVA照射对HSF中miR-1246表达的影响

起始时照射UVA与照射3 d时，UVA组与对照组miR-1246 的相对表达差异均无统计学意义（t=1.29、2.52，均P ＞0.05）。在照射7 d、14 d 时，UVA组均低于对照组，差异均有统计学意义（t=29.84、31.93，均P ＜0.01）。见图2。

二、慢病毒载体介导miR-1246 过表达及实时定量PCR 验证

转染后7、14 d 时的转染效率均大于90%（图3）。RT-PCR 显示，转染后7、14 d 时miR-1246表达水平（10.15 ± 0.18、9.79 ± 0.40）高于对照组（4.20 ± 0.34、3.61 ± 0.34），差异有统计学意义（t =22.72、41.92，P均＜0.01）；转染组7、14 d 的miR-1246相对表达水平差异无统计学意义（t = 1.56，P ＞0.05）。

图2 RT-PCR 检测UVA 照射对人皮肤原代成纤维细胞miR-1246表达的影响 a：两组比较，P ＜0.05

三、miR-1246与靶点基因MAPK14结合的验证

与野生型MAPK14 双荧光素酶报告载体共转染时，miR-1246 质粒组细胞荧光活性（0.41±0.09）低于空白质粒组（1.22±0.218），差异有统计学意义（t=4.69，P ＜0.05）；与突变型MAPK14双荧光素酶报告载体共转染时，miR-1246 质粒组细胞荧光活性（1.16±0.16）与空白质粒组（1.21±0.18）差异无统计学意义（t=0.25，P=0.82）。

四、上调miR-1246 表达对HSF 细胞增殖的影响

MTT结果显示，空白对照组、UVA组、miR-1246组、UVA+miR-1246组细胞增殖活性（0.82±0.03、0.23±0.02、0.81±0.02、0.61±0.02）差异有统计学意义（F = 34.90，P ＜0.05），UVA 组低于空白对照组（t = 28.14，P ＜0.01）；UVA + miR-1246 组低于miR-1246 组（t=10.61，P ＜0.01），高于UVA 组（t=20.30，P ＜0.01）。

五、上调miR-1246 表达对HSF 细胞增殖的影响

β 半乳糖苷酶染色检测显示，空白对照组、UVA组、miR-1246组、UVA+miR-1246组阳性细胞率（3.93%±1.11%、81.29%±2.53%、5.50%±1.15%、54.13% ± 2.09%）差异有统计学意义（F = 16.14，P ＜0.05），其中UVA组高于空白对照组（t=48.46，P ＜0.01）；而UVA+miR-1246 组高于miR-1246 组（t = 35.31，P ＜0.01），低于UVA 组（t = 14.32，P ＜0.01）。见图4。

六、上调miR-1246 表达对老化相关基因的影响

图3 荧光显微镜观察转染荧光标记的miR-1246表达载体的人皮肤原代成纤维细胞转染效率 转染后7、14 d时转染率均大于90%

图4 β 半乳糖苷酶染色检测上调miR-1246 表达对人皮肤原代成纤维细胞老化的影响 UVA 组老化细胞比例高于空白对照组；而UVA+miR-1246组高于miR-1246组，低于UVA组

RT-PCR 显示，空白对照组、UVA 组、miR-1246组、UVA + miR-1246 组MAPK14 mRNA、MMP-1 mRNA 的相对表达差异均有统计学意义（F =15.24、34.56，均P ＜0.05），其中UVA组高于空白对照组（t = 10.49、7.70，P ＜0.05），UVA + miR-1246组高于miR-1246 组（t=11.58、12.60，P ＜0.01），低于UVA组（t=11.63、6.17，P ＜0.05）。见图5。

七、上调miR-1246 表达对老化相关基因蛋白表达的影响

Western 印迹显示，空白对照组、UVA 组、miR-1246 组、UVA+miR-1246 组MAPK14、MMP-1的相对表达差异均有统计学意义（F = 23.56、32.74，P ＜0.05），其中UVA 组高于空白对照组（t=12.53、15.35，P ＜0.05），UVA + miR-1246 组高于miR-1246 组（t=24.78、32.15，P ＜0.01），低于UVA组（t=10.43、15.64，P ＜0.05）。见图6。

讨 论

图5 RT-PCR 检测上调miR-1246 表达对人皮肤原代成纤维细胞MAPK14、MMP-1 mRNA表达的影响 a：两组比较，P ＜0.05

光老化是一个复杂的过程，由多种基因和生长因子共同调控。UVA 照射在光老化的发病机制中发挥重要作用。miRNA 是一类具有转录调节功能的非编码小RNA，其在多种生理和病理过程如基因表达、细胞增殖、分化、凋亡、组织代谢和肿瘤生成中有重要作用［4］。miR-1246位于人2q31.1，通常与其靶基因mRNA以序列互补性的机制负调控靶基因，作用方式是miR-1246 5′端种子序列（第2-7nt）与靶基因mRNA 3′UTR区进行碱基配对，配对的紧密程度决定miRNA对靶基因的抑制程度［5-6］。

图6 上调miR-1246 表达对对人皮肤原代成纤维细胞老化相关蛋白水平的影响 6A：Western 印迹检测MAPK14、MMP-1蛋白的水平；6B：a，两组比较，P ＜0.05

本研究证实，UVA 照射可以诱导miR-1246 表达下调。通过miR-1246慢病毒表达载体转染成纤维细胞，上调miR-1246 的表达并维持在较高水平后发现，miR-1246 的表达上调能促进UVA 诱导的光老化细胞的增殖活性，β半乳糖苷酶染色检测亦显示，上调miR-1246 的表达可降低UVA 诱导的光老化细胞比例。以上均提示，上调miR-1246 的表达可以抑制UVA 照射诱导的细胞老化，miR-1246具有抗光老化作用。

近来研究发现，p38 信号通路是MAPK 通路的一个重要分支，它在炎症细胞、应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。MMP-1 是皮肤光老化的主要相关蛋白酶，也是MAPK信号转导通路的下游效应分子，并可降解多种胶原和蛋白聚糖，对于维持皮肤的光泽和弹性具有重要作用［7］。本研究中，UVA照射成纤维细胞后MAPK14 以及MMP-1 mRNA 及蛋白表达水平均显著增高。既往文献显示，p38激活可使转录激活因子AP-1 活化，与MMP-1 基因结合，促进MMP-1 转录，使之水平增加［8］，本文结果与之相符，与之对应的是UVA 照射后成纤维细胞增殖活性下降，老化细胞比例增加。

进一步研究发现，上调成纤维细胞miR-1246的表达，可下调MAPK14、MMP-1 mRNA 及蛋白的表达，同时MTT 结果显示，上调miR-1246 表达后照射UVA 较单纯照射UVA 组细胞活性增加，老化细胞比例降低。通过双荧光素酶报告基因系统也验证了miR-1246 有MAPK14 mRNA 靶向结合的能力。因此，我们推测UVA 照射可能通过降低miR-1246表达，上调基因MAPK14的表达，活化MAPK 信号转导通路，促进MMP-1 增加，加速成纤维细胞光老化，增殖活性下降。

综上，本研究证实，miR-1246在UVA诱导的光老化细胞显著下调，上调其表达则能提高光老化细胞的增殖能力，降低老化相关蛋白的表达，而miR-1246 的调控作用可能是通过作用于靶基因MAPK14 实现，提示miR-1246 的表达下调在UVA诱导光老化的形成和进展中可能发挥重要的作用。

此外，本实验并未进行下调miR-1246 表达后是否会促进UVA 诱导的光老化、降低细胞增殖活性的研究，有待进一步证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突