非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486和miR-150表达水平及临床意义

胡雪红，谭 琛，安立敏，王志娟，王凤楠

心房颤动是常见的慢性持续性心律失常之一，导致心房失去收缩功能[1]。目前临床病例中心房颤动多由非瓣膜病引起，而非瓣膜性心房颤动病人发生脑卒中风险较高，对病人危害较大[2]。临床主要采用手术或药物等方式治疗心房颤动，但治疗效果不佳，因而需寻找新型生物标志物并以此提高临床治疗效果。微小RNA(microRNA，miRNA)是长度为20～25个核苷酸的单链内源性非编码分子并具有保守性和特异性，有研究表明miRNA可参与心房颤动的心房重构并在疾病的发生、发展中发挥重要作用[3]。miR-486分布于心肌细胞中并通过调控靶mRNA表达进而参与心功能调节[4]。相关研究表明，miR-486与miR-150共同作用并参与心肌梗死的发生及进展过程，并可能是心肌梗死的新型生物标志物[5]。本研究观察非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486与miR-150表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2018年8月我院收治的非瓣膜性心房颤动病人86例作为研究组，另选取同期收治的窦性心律病人67例作为对照组。研究组，男52例，女34例，年龄48～75(59.37±9.89)岁；对照组，男37例，女30例，年龄49～76(62.03±10.34)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究组纳入标准：心电图特征符合相关诊断标准[6]，符合非瓣膜性心房颤动病人相关诊断标准[7]，临床资料完整者；对照组心电图检查与既往病史均无心房颤动，临床资料完整者。排除标准：近期接受心房颤动复律术病人；急性、慢性炎症性疾病病人；自身免疫性疾病病人；患有恶性肿瘤；严重肝肾功能不全；妊娠期妇女；发病初期服用维生素或叶酸者。本研究经医院伦理委员会批准，且病人知情并签署同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 试验仪器与试剂 电泳仪购自北京六一仪器厂，离心管购自美国Axygen公司，超低温冰箱购自日本Sanyo公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪选购自Applied Biosystems公司，RNA提取试剂盒购自Bio Teke公司，SYBR Green qPCR Mix试剂盒购自Thermo Fisher公司，All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection kit试剂盒购自美国Gene Copoeia公司。全自动血细胞分析仪BC-5380购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；TBA 120FR全自动生化分析仪购自日本东芝公司。

1.2.2 血液样本收集 收集两组研究对象入院后次日清晨空腹外周血样本，分别抽取5 μL血液并置于EDTA抗凝管中，其余血液样本按要求置于普通生化管内。将EDTA抗凝管中的血液样本于室温下静置，30 min后以3 000 r/min离心10 min，将分离得到的上层血浆在2 h内分装至EP管中，置于-80 ℃超低温冰箱保存待测。

1.3 观察指标

1.3.1 qRT-PCR法检测miR-486与miR-150表达水平 取冻存的血浆样本并在离心管中按照200 μL血浆加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液(1︰5)进行裂解样本。按照RNA试剂盒说明书提取总RNA，将RNA反转录为cDNA并以其为模板分别对miR-486与miR-150进行qRT-PCR检测。miR-486与miR-150均以U6为内参基因，其中miR-486正向引物序列为5′-GATCAATCCTGTACTGAGCTGC-3′，miR-150正向引物序列为5′-TAGACGCGTCCGCGAGAGA-3′，miR-486与miR-150反向引物序列均由试剂盒内提供，U6正向引物序列为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系为20 μL：SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反应为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，每个样本进行3次平行试验，采用2-ΔΔCt计算miR-486与miR-150相对表达量。

1.3.2 心脏彩超检查 所有病人均在医院B超室进行心脏彩超检查，测定左房内径(LAD)等。

1.3.3 生化指标检测 将普通生化管内血液样本简单离心，抽取上层血浆采用氧化酶法检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。采用免疫比浊法检测血清C反应蛋白(CRP)水平。采用全自动血细胞分析仪检测白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)及红细胞比容(HCT)，采用全自动生化分析仪进行血肌酐(SCr)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)。心房颤动卒中风险评估工具为CHADS2评分系统和2010欧洲心房颤动管理指南推出的CHA2DS2-VASC评分系统评分，心房颤动出血风险评分标准(HAS-BLED)评定心房颤动出血风险评分。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较(见表1)

表1 两组临床资料比较

2.2 两组血浆miR-486与miR-150表达水平比较 与对照组比较，研究组血浆miR-486与miR-150表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血浆miR-486与miR-150表达水平比较(±s)

2.3 研究组血浆miR-486、miR-150与临床指标的相关性分析 采用Pearson分析非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486、miR-150表达水平与临床指标的相关性，结果显示miR-486与miR-150呈正相关(P<0.05)，详见图1。miR-486、miR-150与LAD、CRP呈负相关，与LDL-C、TC呈正相关，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

图1 血浆miR-486与miR-150表达水平的散点图

表3 研究组血浆miR-486、miR-150及与临床指标的相关性

2.4 ROC分析miR-486、miR-150预测非瓣膜性心房颤动的诊断价值 ROC分析结果显示：miR-486敏感度为59.30%，特异度为93.02%，截断值为0.84；miR-150敏感度为82.56%，特异度为70.93%，截断值为1.14。详见图2、表4。

图2 miR-486、miR-150对非瓣膜性心房颤动的ROC曲线图

表4 研究组血浆miR-486、miR-150对非瓣膜性心房颤动的ROC分析

2.5 影响非瓣膜性心房颤动相关因素的Logistic多元回归分析 将影响非瓣膜性心房颤动的相关因素进行Logistic多元回归分析结果显示：LAD、CRP、miR-486与miR-150表达水平均为非瓣膜性心房颤动发生的危险因素，详见表5。

表5 影响非瓣膜性心房颤动相关因素的Logistic多元回归分析

3 讨 论

心房颤动是临床常见的心律失常易引起心功能障碍、卒中等，严重影响病人生活质量，其中非瓣膜性心房颤动发病率与死亡率近年来呈上升趋势[8]。目前心房颤动整体治愈率低且复发率高可能与发病机制未明确有关，以往研究表明炎症反应、心房重构、心肌细胞凋亡等是心房颤动发生的重要原因[9]。有研究已证实，miRNA通过调控心肌离子通道、心肌纤维化或细胞外基质沉积参与心房颤动的心房重构[10]。因此，本研究探讨miRNA在非瓣膜性心房颤动病人血浆表达水平并分析其与病人临床生化指标关系，为进一步探讨非瓣膜性心房颤动发病机制，提高临床治疗效果提供理论依据。

miR-486可在心肌细胞表达，并根据miRNA靶点数据库预测到FoxO1a为miR-486的靶基因，有研究表明FoxO家族参与调节多种细胞功能，FoxO1a在心肌供血与心肌细胞有氧代谢过程中发挥重要作用[11]。相关研究表明，miR-486通过抑制靶基因表达促进磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信号通路表达，进而抑制心肌纤维化并有效改善心室重构[12]。本研究通过qRT-PCR法检测非瓣膜性心房颤动与窦性心律病人血浆miR-486表达水平，结果显示研究组血浆miR-486表达水平低于对照组，说明非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486呈低表达水平。进一步分析miR-486与非瓣膜性心房颤动病人生化指标相关性，结果显示miR-486与LAD、CRP呈负相关，与LDL-C、TC呈正相关，其中LDL-C、TC等生化指标与CRP水平异常与非瓣膜性心房颤动发生有关，且CRP水平随着心力衰竭程度加重而升高[13-14]。提示miR-486可能参与心房颤动的发生及发展过程。本研究ROC分析结果显示：miR-486诊断非瓣膜性心房颤动具有较高的诊断效率，提示血浆miR-486表达水平可能成为临床早期诊断非瓣膜性心房颤动的生物标志物。

miR-150位于人类染色体19q13.33并参与体内较多疾病的发生过程，有研究表明脓毒症病人外周血miR-150表达水平降低并促进靶基因肿瘤坏死因子-α与白细胞介素-10等含量增加，导致机体炎症反应加重[15]。相关研究报道，miR-150不仅在心肌梗死病人表达异常，同时通过调控促凋亡基因(早期生长反应因子2)与p2x7r进而减少心肌细胞死亡并改善心功能[16]。miR-150通过调控靶基因c-Myb表达从而改善心肌梗死后心肌纤维化[17]。相关研究表明，miR-150在高糖诱导的心肌肥大病人体内低表达，p300呈高表达，同时miR-150可调控p300介导的心肌肥大[18]。本研究结果显示，研究组血浆miR-150表达水平低于对照组，说明非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-150呈低表达。进一步分析发现miR-150与LAD、CRP呈负相关，而与LDL-C、TC呈正相关，说明随着疾病严重程度加重，miR-150表达水平降低，提示miR-150表达水平降低并促进靶基因表达水平升高进而促进病情发展。miR-150表达水平升高可降低靶基因表达进而抑制心肌纤维化或炎症反应从而缓解病情。进一步分析miR-150对非瓣膜性心房颤动的诊断价值，结果显示miR-150敏感度为82.56%，特异度为70.93%，截断值为1.14，提示血浆miR-150表达水平可作为早期诊断非瓣膜性心房颤动的生物标志物。

本研究对miR-486与miR-150进行相关性分析，结果显示非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486与miR-150呈正相关，说明两者在心房颤动发生过程中发挥重要作用。Logistic多元回归分析结果显示：LAD、CRP、miR-486与miR-150表达水平均为非瓣膜性心房颤动发生的危险因素。本研究结果提示血浆miR-486与miR-150表达水平降低提示其可能发生非瓣膜性心房颤动，并均与病人临床指标密切相关。

综上所述，非瓣膜性心房颤动病人血浆miR-486与miR-150表达水平均降低，二者呈正相关并与非瓣膜性心房颤动发生、发展之间存在显著相关性，可作为临床早期诊断疾病发生的重要生物标志物。但本研究存在不足之处，关于miR-486与miR-150在非瓣膜性心房颤动发生过程中的具体作用机制需进一步研究。