实验小鼠脂肪组织石蜡切片制作方法的改进

菅晓婷，付 超，岳 丹，杜圣家，郭林芝

脂肪组织是机体重要的能量仓库，广泛分布于全身的皮下及内脏各处[1]，薄层疏松的结缔组织将其分割成许多小叶结构[2]，小叶内有大量的脂肪细胞。近年来，人们越来越重视对脂肪组织的研究[3-5]，而这些研究都离不开形态学方面(如HE、免疫组化染色)的观察。因此，制作优质的脂肪组织切片标本至关重要。由于脂肪组织结构特殊，含有大量的油脂成分，如果组织固定、脱水脱脂不完全，切片时往往出现组织碎渣，有空洞、触摸较软、放置后蜡块表面有凹陷、不易保存等各种问题影响后续的观察及研究[6-8]。本实验室参照董学易等[9]的方法制作脂肪组织石蜡切片，虽基本满足形态学研究，但整个流程所用时间较长，效率较低，减慢了科研进程。为制作更好的脂肪组织石蜡切片，同时缩短制作时间，本科室在此基础上进行改进，并应用于免疫组化和免疫荧光染色，获得了较为满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级BALB/c雄性小鼠6只，8周龄，体重22～25 g，均购自山西医科大学实验动物中心。

1.1.2实验试剂及仪器 Leica RM2245型半自动旋转式切片机；10%中性福尔马林、95%乙醇、二甲苯购自天津市大茂化学试剂厂；切片石蜡(熔点60～62 ℃)购自北京北化康泰临床试剂公司；苏木精、伊红染液购自珠海贝索公司；Rabbit Anti-GLP-1R antibody(货号bs-1559R)购自北京博奥森生物公司；山羊抗兔IgG/HRP聚合物(货号PV-6001)和山羊抗兔IgG/TRITC(货号ZF-0316)均购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1取材及组织处理 颈椎脱臼法处死实验小鼠，每只鼠分别取双侧睾丸脂肪垫，双侧肾周脂肪组织及2块大小均等的肠系膜脂肪组织，标本共36块，大小为(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm×(0.2～0.3)cm，三个部位的脂肪组织均等分为实验组和对照组，每组各18块。所有标本均经10%中性福尔马林浸泡固定。其中，对照组标本采用董学易等[9]所述程序进行，实验组标本采用改进程序进行(表1)。处理好的脂肪组织标本用Leica石蜡包埋机进行包埋。

表1 两组脂肪组织处理流程表

1.2.2切片、展片及烤片 用Leica RM2245型半自动旋转式切片机进行切片，切片厚4 μm。在水温42 ℃进行展片，60 ℃烤片30 min～1 h。

1.2.3HE、免疫组化及免疫荧光染色 HE、免疫组化及免疫荧光染色按常规流程进行，抗体为Rabbit Anti-GLP-1R antibody，阳性表达定位于细胞膜，免疫组化采用DAB显色，免疫荧光采用TRITC显色。

2 结果

2.1 两组脂肪组织切片、展片及HE染色比较实验组脂肪组织蜡块质地均匀，组织完整，呈淡黄色半透明状，可进行连续切片，且切片完整无空洞，无碎渣，展片完全，无褶皱，组织未散。经HE染色，镜下可见脂肪组织无裂缝，细胞排列紧密，形态饱满，呈多边形空泡状，胞核呈扁圆形，清晰可见，胞膜无明显断裂、松散(图1A)。

对照组脂肪组织石蜡块与实验组石蜡块相比无明显区别，可连续切片，但组织中央可见细小裂缝，展片后明显。经HE染色，镜下可见脂肪组织形态基本完整，局部可见裂缝，细胞排列紧密，但形态欠饱满，胞核扁平，清晰可见，部分细胞膜有断裂，松散(图1B)。

2.2 实验组脂肪组织石蜡切片在免疫组化和免疫荧光中的应用实验组切片在进行免疫组化和免疫荧光染色过程中未见明显脱片，镜下可见脂肪组织完整，细胞形态饱满，胞膜完整，免疫组化标记GLP-1R呈棕黄色，免疫荧光可见较强的红色信号，阳性表达明显，背景清晰(图2)。

①A①B②A②B

3 讨论

脂肪组织主要由脂肪细胞构成，脂肪细胞内含有大量脂滴，而脂滴的主要成分是三酰甘油脂。由于其成分的特殊性，不能按照普通组织的脱水流程进行处理，若脱水、脱脂不完全，石蜡便难以进入组织从而起不到支撑作用，蜡块中的组织会塌陷、皱缩，切片时会出现空洞，碎渣等情况。实验室常用的脱水、脱脂试剂为乙醇，乙醇分子中含有极性基团羟基(-OH)，与组织中的水形成氢键将水置换出来起到脱水作用。通过本实验，作者认为对于含水少的脂肪组织，乙醇除了有脱水作用，还可以与三酰甘油脂发生醇解反应，生成水溶性的甘油和乙酯，将脂肪细胞中的脂滴溶解，从而使浸蜡更为彻底。也有文献记载乙醇脱脂是利用乳化作用[10]。但是，不论乙醇是应用何种原理脱脂，都会消耗大量乙醇，所以我们需要延长乙醇处理组织的时间。虽然有研究表明温度一定的条件下，乙醇浓度越高，脱脂率会越高[11]，但高浓度的乙醇迅速脱水，会使组织收缩，表面变硬，进而影响乙醇继续进入细胞内脱水脱脂，所以应当从低浓度乙醇开始逐渐向高浓度乙醇梯度过渡，并且延长中低浓度乙醇脱水时间。本文实验组与对照组相比，增加了70%乙醇和90%乙醇，并延长了在低浓度乙醇中的时间，缩短了在高浓度乙醇中的时间，组织充分脱水脱脂，取得了较为满意的制片效果。而对照组程序乙醇梯度设置少，且脱水、脱脂时间延长主要在95%乙醇，以至组织迅速收缩，乙醇很难进入细胞溶解置换脂质并进行脱水，最后制作的石蜡块在切片时有裂缝，使形态学观察及后续研究受到一定影响。

此外，二甲苯不仅有透明作用，也有良好的脱脂效果，二甲苯可以兼顾乙醇脱脂不彻底的情况[12]，但是组织浸泡二甲苯时间过长会硬化变脆。制作一张优质的脂肪切片，固定也尤为重要，固定液体积要为标本体积的10～20倍[13]，并且盖上纱布以防脂肪组织漂浮固定不充分，但固定时间越长，抗原被封闭和破坏越多，影响免疫组化及分子生物学检测的阳性率。与对照组相比，实验组缩短了固定时间，不仅制出优质切片，而且免疫组化及免疫荧光染色检测阳性率高，效果良好。

综上，本实验室改进了实验小鼠脂肪组织石蜡切片的制作流程，使用改良流程制作的切片组织形态完整，无裂缝，无褶皱，经染色可见胞膜完整，胞核清晰，抗原保存好，极大地提高了科研的进度，为后续科研的进行提供了优质的切片基础。