阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠Ang-1及其受体Tie2 mRNA表达的影响

2020-07-20陈仕毅付玉平冯晓晶刘少奎

中国医科大学学报 2020年7期

陈仕毅，付玉平，冯晓晶，刘少奎

（1.大连大学附属中山医院循环科，辽宁大连 116001；2.中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001；3.北部战区总医院和平院区骨科，沈阳 110042）

血管新生在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发病及治疗过程中起关键性作用。在众多的促血管生成、发展及成熟因素中，最重要的是促血管生成素（angiopoietin，Ang）及其受体（Ang/Tie2）系统。Ang-1为内皮细胞特异生长因子，与Tie2受体结合，在血管新生、调控血管的完整性、维持其稳定性过程中发挥作用［1］。研究［2］发现，阿托伐他汀保护心血管的功能与其调脂作用无关，其是否对微血管新生具有潜在的药物作用机制研究相对较少。本研究通过建立大鼠AMI模型，观察阿托伐他汀药物治疗对AMI大鼠心肌组织Ang-1及其受体Tie2mRNA表达水平的影响，探讨阿托伐他汀药物在AMI血管生成过程中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型建立

1.1.1 动物分组：6～8周龄雄性SD大鼠80只，体质量200～250 g，购自大连医科大学实验动物中心。在室温20～25 ℃的动物房中饲养3 d后，将大鼠随机分3组：正常（CG）组20只、单纯心肌梗死（AG）组30只、心肌梗死联合阿托伐他汀（AAG）组30只。

1.1.2 建立AMI模型：使用氯胺酮与速眠新药物麻醉AG与AAG组大鼠；将大鼠仰卧固定于操作台上，使用大鼠灌胃直针（65 mm）进行气管插管，深约40～50 mm，动物呼吸机设置参数为频率60次/min，潮气量30 mL，呼吸比率1 ∶1；于胸骨左缘心脏搏动最强点上一肋间（即第4、5肋间）做一斜行长约1 cm切口，打开胸腔并钝性分离开心包，于左心耳下方冠状动脉（以下简称冠脉）走行处，距离肺动脉根部3 mm结扎，深度 ≥ 1 mm，结扎后可见左心室心肌苍白变薄，观察大鼠生命体征变化，关闭胸腔并保持胸腔负压状态，冲洗消毒后缝合；AG组在术后3 d开始给予阿托伐他汀［10 mg/（kg·d）］灌胃，AG组及CG组以同等剂量生理盐水灌胃，最终获得CG组20只，AG组24只，AAG组25只，在灌胃后0 d、14 d 和28 d，分别取梗死部位心肌组织。

1.2 主要试剂及仪器

阿托伐他汀钙（美国辉瑞制药有限公司），PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司），DNA Marker（上海生工生物工程有限公司），UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司），M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司），引物合成（上海生工生物工程有限公司），高速微型离心机（DGW99）型（深圳市点晶科学仪器有限公司），紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司），DY-300型低压电泳仪（汕头市医用设备厂有限公司），电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂），动物呼吸机ALC-V8（上海奥尔科特生物科技有限公司）。

1.3 实时PCR检测Ang-1及其受体Tie2 mRNA的表达

分别于灌胃14 d和28 d处死大鼠，取AG组及CG组及AAG组大鼠的心肌组织，依据RT-PCR试剂说明书，按步骤分别检测Ang-1及其受体Tie2mRNA的表达量。

1.3.1 提取RNA：称取不少于30 mg的心肌组织，将研磨后的心肌组织置于离心管中加入RLT Solution震荡混匀，离心并吸取上清液加入无水乙醇后混匀，使用吸附柱及DEPC-treated ddH2O获得RNA溶液。

1.3.2 RNA纯度的测定：使用DEPC处理水将提取的RNA稀释，使用紫外分光光度计测定A260值及A280值。用DEPC-Treated ddH2O作为空白对照。

1.3.3 RNA反转录：将提取的RNA加入Oligo（dT）及RNase-free ddH20后混匀并离心，65 ℃温浴5 min，冰浴30 s，离心。分别加入反应物Reaction Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix 2 μL、M-MuLV RT 1 μL，混匀后离心。在PCR仪上进行cDNA合成（42℃），终止反应（70 ℃）。

1.3.4 实时PCR：cDNA产物加入上游Primer、下游Primer、Taq DNA Polymerase等试剂，通过变性、退火、延伸等步骤进行扩增，Tie2、Ang-1、β-actin退火温度分别为57 ℃、55 ℃、58 ℃。

1.3.5 PCR产物检测：PCR产物用1%琼脂糖凝胶溶液进行电泳，在紫外观测仪上观察电泳结果，采用凝胶成像系统拍照并分析条带。

1.4 病理学检查

2周处死大鼠，取左心室冠状面梗死区中部切片，置于4 %的多聚甲醛溶液中固定10 h石蜡包埋待用。制5 μm厚切片，随机取3张切片进行观察，切片HE染色（苏木精和伊红染色法）。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 AMI模型大鼠心肌细胞的病理改变

光镜下，正常大鼠心肌细胞排列有序紧密，无明显炎症细胞浸润；冠脉结扎术后大鼠心肌细胞排列紊乱、稀疏，有中性粒细胞浸润，见图1。

2.2 阿托伐他汀影响AMI大鼠Ang-1及其受体Tie2 mRNA的表达

阿托伐他汀作用AMI大鼠14 d时，AAG组及AG组Tie2mRNA的表达高于CG组，AAG组明显高于AG组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（见图2，表1、2）；Ang-1mRNA在AAG组、AG组及CG组的表达，组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05，见图2，表1、2）。

图1 AMI模型大鼠心肌细胞的病理变化 HE染色×400Fig.1 Pathological changes in myocardial cells of AMI rats HE staining×400

图2 阿托伐他汀对AMI大鼠Ang-1及Tie2 mRNA的表达影响（药物作用14 d）Fig.2 Effect of atorvastatin on mRNA expression of Ang-1 and Tie2 in AMI rats（14 d after drug action）

表1 阿托伐他汀对AMI大鼠Tie2 mRNA表达的影响（）Tab.1 Effect of atorvastatin on Tie2 mRNA expression in AMI rats（）

1）P ＜ 0.05 compared with the CG group.

阿托伐他汀作用AMI大鼠28 d时，Tie2mRNA的表达在AAG组及AG组、CG组中，组间表达无明显差异（P＞ 0.05）；Ang-1mRNA的表达在AAG组及AG组及CG组，组间表达无统计学差异。见图3，表1、2。

3 讨论

在缺血性冠脉疾病中，形成冠状动脉侧支循环主要有3种途径，即主干血管的延伸生长，毛细血管网络的形成和侧支动脉的产生［3］。他汀类药物目前被广泛应用于防治心脑血管疾病。研究［4］发现他汀类药物除降脂作用外，还可以促进缺血组织中的血管再生成。通过增加冠状动脉的侧支循环来治疗AMI，但其具体机制尚不明确。

表2 阿托伐他汀对AMI大鼠Ang-1基因表达的影响（）Tab.2 Effect of atorvastatin on Ang-1 gene expression in AMI rats（）

1）P ＜ 0.05 compared with the CG group.

图3 阿托伐他汀对AMI大鼠Ang-1及Tie2的基因表达影响（药物作用28 d）Fig.3 Effect of atorvastatin on gene expression of Ang-1 and Tie2 in AMI rats（28 d after drug action）

Ang/Tie2系统是调控血管新生的途径［5-8］，其中Ang-1/Tie2途径是维持血管完整性的重要因子，同时在新生血管形成、发展及成熟的过程中起重要作用［9］。JONES等［10］认为Ang-1与Tie2受体结合，能够促进Tie2受体磷酸化，维持血管完整性并调节血管功能。YIN 等［11］研究证实Ang-1通过PI3信号传导通路激活Tie2，改善心肌老化。KIM［12］提出Ang-1通过抑制高脂血症诱发的冠状动脉内皮细胞的凋亡，维持内皮细胞稳定性。陈仕林等［13］的研究证明，用Ang-1基因干预治疗的AMI心肌周围毛细血管密度显著高于正常对照组。VASA等［14］的研究发现他汀类药物能促进内皮祖细胞动员、迁移以及分化，促进梗死区域血管再生。有研究［15-17］发现，他汀类药物可通过PI3K/Akt信号传导途径促进血管新生。

本研究基于他汀类药物在血管新生方面的作用，研究其在AMI血管新生过程的作用及其机制。结果显示，14 d时Tie2 mRNA表达，AMI组与正常组相比，差异有统计学意义，AAG组与AG组Tie2mRNA差异有统计学意义，说明在AMI区域Tie2的表达升高，且Tie2在AAG组中表达明显升高。14 d及28 d时Ang-1的表达正常组与AG组相比，AAG组与AG组相比，差异均无统计学意义。研究［18］发现，建立AMI模型后，在非梗死区心肌组织中Tie2mRNA表达没有变化，而在梗死区心肌组织中表达明显升高，Ang-1mRNA的表达水平在梗死区与非梗死区均无变化，本研究结果与其一致。研究中发现正常组与AG组Ang-1mRNA表达没有差异，但AG组均数均比正常组大，说明Ang-1mRNA表达还是相对上调的，分析原因可能是与研究选取时间及样本量有关。在14 d时AAG组Tie2mRNA表达较AG组升高，在28 d时Tie2的表达与正常组无差异，说明阿托伐他汀可能只具有在早期通过上调Tie2mRNA促进血管再生作用。Tie2mRNA表达是上调能够激活了内源性血管生成机制，Ang-1在内皮细胞表达促进血管新生、成熟和稳定［19］，但与本研究结果Tie2mRNA表达升高，Ang-1mRNA的表达无变化矛盾。进一步推测可能是阿托伐他汀药物通过上调Tie2mRNA表达促进血管新生。

综上所述，本研究基于他汀类药物在血管新生方面的作用，研究其在AMI血管新生过程的作用及机制。Ang-1及Tie2的表达水平与AMI血管新生间呈一定的相关性。由此推测，阿托伐他汀钙可能通过上调Tie2mRNA表达共同促进血管新生，Ang-1是他汀类药物促血管新生的重要介导因素，这可能为阿托伐他汀在促进新生血管，治疗缺血性心脏病的临床应用提供了理论依据。