七叶皂苷对乳腺癌细胞MDA-MB-231和T-47D增殖的影响

刘红梅, 文钦琳, 唐琳, 李峰

七叶皂苷对乳腺癌细胞MDA-MB-231和T-47D增殖的影响

刘红梅, 文钦琳, 唐琳, 李峰

(湖南文理学院 生命与环境科学学院, 湖南 常德, 415000)

以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T-47D为研究对象, 通过MTT方法, 检测不同浓度七叶皂苷(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 µmol/L), 对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T-47D体外增殖的影响。结果表明: 不同浓度七叶皂苷处理MDA-MB-231细胞, 发现七叶皂苷对MDA-MB-231肿瘤细胞没有明显的抑制作用。七叶皂苷可明显抑制人乳腺癌T-47D细胞的生长, 并且呈现明显的剂量和时间依赖性, 表明七叶皂苷对乳腺癌T-47D细胞具有抑制作用。

七叶皂苷; 乳腺癌细胞; MDA-MB-231; T-47D; 增殖影响

乳腺癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤之一, 仅次于宫颈癌, 全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌, 发病率为10%～15%, 并以每年10%～20%的幅度上升。实验室及流行病学研究结果均表明, 乳腺癌治病危险因子与雌激素的暴露有关, 而全球工业化污染的加重导致人类体内雌激素的实际负荷量增加, 使乳腺癌发病率呈逐渐上升趋势。乳腺癌死亡原因几乎均为远处转移, 经术前常规检查没有发现任何转移迹象的患者20%将于术后出现复发和转移, 经肿瘤专家分析乳腺癌术后远处复发较多, 约半数在2年内复发[1–4]。

国内外对七叶皂苷(Aescin or escin)的研究还不是很多。近年来研究表明七叶皂苷类化合物具有一定的药理作用, 如抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、促进造血以及抗氧化等作用。七叶皂苷可以影响细胞膜的稳定性。保护肝脏、抑制肿瘤、治疗多发性硬化症和促进机体造血等功能。因此, 七叶皂苷类化合物的研究开发近年来备受重视, 成为药物和保健食品的开发热点。有关七叶皂苷的抗肿瘤活性及其作用机理值得深入研究[5]。本文研究七叶皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和T-47D细胞的增殖、凋亡、周期的影响, 为七叶皂苷的开发及应用提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺癌细胞株

乳腺癌细胞MDA-MB-231和T47D。

1.1.2 主要药品和试剂

七叶皂苷购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 溶解于DMSO制成浓度为100 µmol/L的储备液, 临用前用DMEM培养液稀释至所需的浓度。

DMEM培养液、RPMI1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、新生小牛血清(Newborn Calf Serum, NBS)、胰蛋白酶溶液、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、双抗(链霉素0.1 mg/mL, 青霉素1 mg/mL)、七叶皂苷(escin)、75%的酒精、二甲基亚砜DMSO、四唑盐MTT。

1.1.3 实验设备与器材

高压蒸汽灭菌锅、CO2培养箱、烘干箱、冰箱(-80 ℃、-20 ℃、0 ℃), 超净工作台, 低速离心机, 显微镜; 1.5 mL离心管, 5 mL离心管, 冻存管、96孔板, 细胞培养瓶, 计时器, 移液枪, 5 µL、10µL、100 µL、1 mL、5 mL枪头, 血球计数板, 烧杯, 量筒、EP管、5 mL玻璃瓶、恒温摇床、酶标仪、纸巾、透明胶、磁盘、通风橱。

1.2 乳腺癌细胞的复苏、培养、冻存和注意事项

1.2.1 细胞的复苏

从-80 ℃的冰箱中取出冻存的人乳腺癌MDA-MB-231细胞或者细胞, 在37 ℃水浴锅内不断摇动促进其融化, 然后移入5 mL离心管中, 在T-47D细胞液中加入4.5 mL的DMEM完全培养基, MDA-MB-231细胞液中加入RPMI1640培养基, 然后轻轻吹匀, 1 000 r/min, 离心5 min, 弃上清液, 然后再分别加4.5 mL的培养液, 500 µL的NBS和100 µL的双抗, 在含5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞的培养

乳腺癌MDA-MB-231细胞或T47D细胞的传代: 细胞密度达到80%～90%时, 取培养基准备传代。

① 在铁盒中取出离心管, 离心管取出后在酒精灯上烤一下盖紧, 打开PBS, 打开离心管盖加100 µL FBS或者200 µL NBS;

② 吸出原培养瓶中的液体倒入废液缸, 吸取5 mL的PBS清洗培养瓶, 一次打进与吸出, 如果培养瓶不干净可以多清洗两次, 然后盖上PBS;

③ 打开胰蛋白酶吸取1 000 µL加入到培养瓶中, 放入培养箱中消化1–2 min;

④ 拿出培养瓶, 轻拍底部拍散细胞, 然后在显微镜下观察细胞是否由贴壁状变为悬浮状(在消化期间可以盖上胰酶打开培养基和离心管盖子);

⑤ 在T-47D细胞液中加4.5 mL DMEM培养基到培养瓶中, MDA-MB-231细胞液中加入4.5 mL RPMI1640培养液, 反复吹散细胞, 然后吸出打入5 mL的离心管中, 800 r离心5 min;

⑥ 离心完后拿出离心管, 弃上清液, 加4.5 mL DMEM或者RPMI1640培养基吹散细胞, 反复吹打10次左右(一定要吹匀, 不能有细胞团);

⑦ 将离心管中的细胞液转入培养瓶中, 加250 µL FBS或者500 µL NBS和100 µL的双抗;

⑧ 做好标记, 改好药品。

1.2.3 细胞的冻存

① 取出离心管, 加入100 µL FBS, 盖好瓶盖;

② 拿出培养瓶弃原液, 取PBS 5 mL清洗培养瓶1到2次(一定要吸干净, 防止稀释胰蛋白酶);

③ 吸取1 000 µL胰蛋白酶到培养瓶中, 放入培养箱中消化1～2 min;

④ 拿出培养瓶, 轻拍底部拍散细胞, 然后在显微镜下观察细胞是否由贴壁状变为悬浮状;

在操作前选小棒，引导学生不要盲目动手，要学会冷静思考后再动手。手脑合用，既是对长方体“棱”认识的知识经验的积累，又是智慧操作的经验积累。在搭建完长方体框架后，学生选择合适的“面”，使长方体面面俱到。

⑤ 加4.5 mL所需培养基到培养瓶中, 反复吹散细胞, 然后吸出打入5 mL的离心管中, 800 r离心5 min;

⑥ 离心后弃上清液, 在离心管中加入1.2 mL的培养液, 轻轻吹打几次, 吹散即可;

⑦ 取出冻存管且在火焰旁将盖子盖紧, 然后打开冻存管, 从离心管中取1.05 mL的细胞液放入冻存管中(取出前充分吹匀);

⑧ 在冻存管中加入300 µL FBS和150 µL冻存液DMSO, 轻慢在冻存管中吹打、混匀, 不可有气泡, 然后过火、盖好瓶盖和做好标记(名称、时间和代数);

⑨ 将冻存管先放入4 ℃冰箱冷藏20 min, 再放入-20 ℃冷冻层一夜, 第二天取出快速放入-80 ℃冰箱。

1.2.4 细胞培养的注意事项

细胞培养必须注意3个环节: 物质营养、生存环境和废物的排除。

① 体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的, 培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素, 一般培养细胞所用的培养基是合成培养基, 它含有细胞生长必需的营养成分, 但在使用合成培养基时需加一些天然成分, 其中最重要的是血清, 以牛血清为主, 由于血清中含有一些不明成分, 对于特殊目的细胞培养是不利的, 为此, 研究人员正在探索无血清培养的条件, 排除了血清中不明因素的干扰;

② 体外培养必须模拟体内细胞的生长环境, 环境因素主要是指: 无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境, 气体主要是CO2和O2, CO2对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要;

③ 活体内生长的细胞所产生的代谢物和废物通过一定的系统利用和排出, 体外培养细胞所产生的代谢物和废物积累在培养液中, 所以定期更换培养液对于维持细胞培养至关重要。

1.3 MTT比色法原理

MTT法又称MTT比色法, 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中, 而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜, 用酶联免疫检测仪在540 nm或720 nm波长处测定其光吸收值, 可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内, MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

使用MTT前要选择适当的细胞接种浓度。一般情况下, 96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大, 因此, 在进行MTT试验前, 要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线, 确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间, 以保证培养终止致细胞过满。这样, 才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低, 太少观察不到差异。

1.4 实验步骤

1.4.1 诱导处理

取对数生长期的乳腺癌MDA-mb-231细胞和T-47D细胞, 倾去上层培养液, 用PBS清洗1–2次, 然后胰蛋白酶消化处理, 并在显微镜下观察, 至大部分细胞成片状飘起, 加入DMEM培养液, 1 000 r/min, 离心5 min去除死细胞, 倒去上清液, 加入新鲜的所需培养液, 轻轻吹打成悬液, 混匀取20 µL细胞液用血球计数板计数,将MDA-MB-231细胞稀释至5×104个/mL的细胞混合液, 将T-47D细胞稀释至5×107个/mL的细胞混合液, 给96孔板加注1 mL/孔细胞混合液备用。接种96孔板, 每孔为1 mL体系, 根据血球计数后算出细胞液的体积, 每个质量浓度各设4个复孔, 每4孔依次加入不同浓度0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 μmol·L-1七叶皂苷, 然后加入一定浓度FBS。盖上盖子, 标上名称、日期、浓度等信息。放入37 ℃、5% CO2的培养箱中培养诱导。分别在24、48、72 h后在10倍镜下拍一次照片, 选择每排的第2或第3个孔拍照, 每孔拍2次。培养结束后在避光条件下每孔加20 µL的MTT, 然后放入培养箱继续培养4 h后进行第四次拍照。

1.4.2 药物检测

将96孔板移至无菌房外, 将培养液弃去, 再将96孔板倒置在纸巾上30 s左右(以便吸取多余的培养液)。在通风橱中操作, 每孔加入150 µL二甲基亚砜DMSO, 加完后用透明胶封起, 从而固定在磁盘。将96孔板放置恒温摇床10 min, 震荡10 min至甲臜完全溶解且颜色均一, 用酶联免疫检测仪在570 nm处测定每孔的吸光度(用OD值表示), 计算抑制率。

1.4.3 数据的整理与分析

利用统计学方法, 所有数据采用SPSS 19.0软件进行分析, 数据采用“均数±标准差”表示, 采用独立样本t检验,＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 七叶皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响

以不同浓度七叶皂苷(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 µmol/L)处理MDA-MB-231细胞, 发现七叶皂苷对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制作用不强, 对于MDA-MB-231肿瘤细胞的生长基本没有影响, 随着药物浓度的增加, 所产生的抑制作用基本不变, 各浓度组之间差异不具有统计学意义(＞0.05), 表明七叶皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞没有明显的抑制作用, 目前用七叶皂苷来抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞是不可行的, 还需更进一步研究其他药物对其肿瘤细胞的影响。通过MTT检测法得到MTT值, 并由OD值计算得到肿瘤细胞的抑制率(表1), 并且绘制了随浓度的增加MTT值变化的曲线(图1)。

图1 MTT法检测七叶皂苷对乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用

表1 七叶皂苷对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制率(x±s, n=4) /%

2.2 七叶皂苷对人乳腺癌T-47D细胞生长的影响

以不同浓度七叶皂苷(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 µmol/L)处理T-47D细胞, 发现不加药物的空白对照组肿瘤细胞生长情况比较好, 没有见到明显的细胞抑制形态学的变化。与空白对照组相比较, 有七叶皂苷作用T-47D细胞后, 肿瘤细胞开始变化, 形状变得不规则, 细胞皱缩变小, 细胞间隙不断增加, 不互相黏着, 倾向于单个生长, 悬浮的细胞变多, 肿瘤细胞间的侵袭性减小。由实验研究结果显示: 随着七叶皂苷药物浓度的增加, 上述肿瘤细胞形态的变化更加明显, 并且在相同的倒置显微镜的视野下观察发现T-47D细胞数量也随着七叶皂苷药物浓度的增加呈现数量减少的趋势, 对照组与各浓度组之间差异具有统计学意义(＜0.05), 表明七叶皂苷对人乳腺癌T-47D细胞具有显著的抑制作用, 并且呈剂量依赖性。通过MTT检测法得到MTT值, 并由OD值计算得到肿瘤细胞的抑制率(表2), 并且绘制了随浓度的增加MTT值变化的曲线(图2)。

图2 MTT法检测七叶皂苷对乳腺癌T-47D细胞的作用

表2 七叶皂苷对乳腺癌T-47D细胞的抑制率(x±s, n=4) /%

3 讨论

恶性肿瘤已成为人类第2大治死病因, 全世界因癌症死亡的人数已到达每年约800万人, 而中国占了约25%, 并且发病率呈年轻化趋势。近20年来, 中国癌症死亡率上升了近30%, 所以要控制癌症死亡率任重而道远。肿瘤对于化疗药物的耐药性及化疗药物毒副作用是降低肿瘤药物疗效的主要因素。现代社会随着经济的快速发展和物质生活水平的不断提高, 恶性肿瘤已成为非常严重的威胁人类健康和生活质量的主要疾病。乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤, 近年来肿瘤的发病率在我国逐年上升, 女性恶性肿瘤的发病率增加不少, 其死亡率也排在[6]。乳腺癌严重威胁着妇女的健康和生命, 极大影响患者的生活质量, 给许多家庭带来了沉重的经济负担和心理压力, 乳腺癌的治疗已成为当前医疗关注的焦点。

七叶皂苷是一种从七叶树科植物中提取到的一种三萜总皂苷, 是中药中具有抗肿瘤的一种药材, 七叶皂苷具有消炎、抗渗出、恢复毛细血管通透性、提高静脉张力、改善血液循环、促进脑功能恢复及神经保护等作用, 用于治疗脑水肿、组织肿胀和慢性静脉功能不全。近年来的研究表明, 七叶皂苷可诱导细胞周期阻滞、肿瘤增殖抑制和肿瘤细胞凋亡[7], 七叶皂苷对人鼻咽喉细胞(KB细胞)增殖具有显著抑制作用, 而且其作用呈剂量和时间的依赖性[8]。因此本文用七叶皂苷作为实验药物, 探讨对其乳腺癌MDA-MB-231细胞和T-47D细胞的增殖影响。

本文采取MTT法检测七叶皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和T-47D细胞的生长抑制作用。结果显示, 对于MDA-MB-231细胞而言, 随着七叶皂苷药物浓度的增加和作用时间的延长, 细胞的存活率基本没变化, 抑制作用不明显, 表明七叶皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞没有明显的抑制作用, 用七叶皂苷来抑制MDA-MB-231细胞目前是不可行的。从实验结果来看, 七叶皂苷对于T-47D细胞的抑制作用比MDA-MB-231细胞要明显得多, 通过各项实验数据显示, 随着七叶皂苷药物浓度的增加和作用时间的延长, 对乳腺癌T-47D细胞具有明显的抑制作用, 细胞的生长率逐渐减少, 且呈剂量和时间依赖性。七叶皂苷可通过抑制细胞增殖抑制人乳腺癌细胞T-47D的生长。

[1] 季宜芳, 姚冬娟. 七叶皂苷对卵巢癌细胞的杀伤及其药理学机制研究[J]. 中医药导报, 2018, 24(18): 25–27, 38.

[2] 王娇. 七叶树内生菌多样性、生物活性及七叶皂苷生物转化研究[D]. 汉中: 陕西理工大学, 2018.

[3] 司玲玲, 马俊, 任欢欢, 等. 刺槐素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(2): 260–267.

[4] 王建伟, 冯爱敏, 任柏林, 等. 不同药物麻醉的乳腺癌患者血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响[J/OL]. 现代肿瘤医学, 2019(2): 210–213[2018–12–27].

[5] 郭淳, 龚永杰, 孙放, 等. 山慈菇水煎剂对人乳腺癌T-47D细胞增殖和迁移的影响[J]. 中医学报, 2017, 32(10): 1 832–1 835.

[6] 郑良栋, 冯涛, 何雪梅, 等. 乳腺癌细胞-干细胞共培养上清液对乳腺癌细胞的体外抗肿瘤作用研究[J]. 药学学报, 2016, 51(4): 552–557.

[7] 王钟. p62在七叶皂苷钠诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用及机制研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2018.

[8] 王道平, 朱筱玲, 赵佳妮, 等.七叶皂苷钠治疗咽喉部炎性疾病的观察及护理[J]. 中国医药指南, 2019, 17(12): 262–263.

Cell proliferation effect of aescin on breast cancer MDA-MB-231 and T-47D

Liu Hongmei, Wen Qinlin, Tang Lin, Li Feng

(Biology and Environmental Science College, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

The effect of different concentrations of Aescin (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 µmol/L) on the proliferation of human breast cancer cell lines MDA-MB-231 and T-47D is studied by MTT assay. The results show that Aescin had no significant inhibitory effect on human breast cancer MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of Aescin. Aescin can significantly inhibited the growth of human breast cancer T-47D cells, and it shows an obvious dose and time-dependent effect, which indicats that Aescinate has an inhibitory effect on breast cancer T-47D cells.

aescin; breast cancer cell; MDA-MB-231; T47D cell; proliferation effect

Q 785

A

1672–6146(2020)03–0049–05

10.3969/j.issn.1672–6146.2020.03.009

李峰, youquanli@126.com。

2019–11–26

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2014]248号)。

(责任编校: 郭冬生)